TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结 1. 几种细胞凋亡检测方法中TUNEL法的优点和缺点是什么？ 2. TUNEL法的实验原理是什么？
3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？ 4. 如何减弱非特异性染色？ 5. 细胞通透的时间如何选择？
6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？ 7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？ 8. DAB的显色时间和条件如何把握？ 9. 首次做TUNEL实验的注意事项？
10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？ 11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？
针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：
1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）： 基本原理： 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
TUNEL方法检测凋亡的讨论
TUNEL方法检测凋亡的原理
ljksbs ：细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物
酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.
TUNEL细胞凋亡详细流程 youngtiger：
TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒
细胞发生凋亡以后，出现多个生物学改变特征，如：细胞膜、染色质凝集、核DNA断裂等等。目前DNA断裂检测是一种广为认可的检测凋亡的方法，这种检测可以通过提取细胞DNA进行凝胶电泳来完成，也可以进行原位检测，即常说的TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记技术）方法。
TUNEL方法的基本原理如下：在TdT酶的作用下，将生物素或者溴标记的核苷酸连接到细胞内断裂DNA游离的3'OH上，然后加入酶标的链霉亲和素或者抗标记核苷酸的抗体，达到原位检测目的。
试剂盒简单操作步骤：
细胞或组织片固定（中性固定液，如3.7％甲醛） 水化（样本依次在100%、95%、70%的乙醇处理） PBS浸泡
蛋白酶K处理标本（蛋白酶K主要应用于组织样本和对照片，Cytonin用于新鲜准备的细胞样本）
双蒸水（dH2O）洗涤
3%H2O2甲醇溶液（Quenching solution）消除内源性HRP
PBS中洗涤
1XTdT标记缓冲液孵育
TdT标记Biotin-dNTP（TdT标记反应混合物） 终止标记反应（1XTdT Stop Buffer） PBS洗涤
Streptavidin-HRP孵育（若使用荧光标记的Streptavidin，则无需进行以下步骤，直接在荧光显微镜下观察）
PBS洗涤 DAB溶液显色 去离子水中洗涤 甲基绿溶液复染
使用TUNEL试剂盒基本注意事项： 避免将试剂盒保存于无霜冰箱中
使用PH中性的固定液固定组织或者细胞，避免使用酸性或者碱性固定液，以免出现认为DNA损伤；推荐使用 3.7％甲醛溶液）
在操作过程中避免出现干片现象
根据标本类型决定孵育时间（蛋白酶K、TdT等），保证最佳效果 使用过程避免将TdT酶置于冰上；避免反复冻溶。
使用试剂盒提供的二价阳离子优化标记反应（Mg2+可降低背景，Mn2+可增强染色；建议使用Co2+开始反应）
按照正确的顺序准备标记混合物；最后一步加入标记缓冲液
使用新鲜的H2O2溶液，孵育后立即将标本放入PBS清洗（H2O2可导致DNA损伤）
liufaquan：应用原位DNA末端转移酶法（TUNEL）观察细胞凋亡 （1）细胞生长片原位，2%为多聚甲醛固定15min，PBS 漂洗5min×3 （2）甲醛、过氧化氢（0.03%）15min，消除内源性过氧化物酶的活性 （3）PBS漂洗5min×3，0.1%TrionX-100 4℃条件下孵育2分钟
（4）滴加DNA末端转移酶及FITC标记dUTP反应混合液50μl，37℃湿盒内孵育1h(1号+2号)
（5）PBS漂洗5min×3，滴加HRP（辣根过氧化物酶）标记的抗FITC抗体(3号)，37℃湿盒内保温1h.
（6）DAB暗处显色5min，终止显色。镜下观察、摄影。
阳性细胞为胞核呈棕黄色，不着色为阴性。同时用PBS代替DNA末端转移酶，作为阴性对照。
nixiao：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
过氧化物酶标记测定法
原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物
酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。
本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。
(一)试剂配制
1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。 2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。 4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。
5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。 6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。
8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR） （二）实验步骤 1、标本预处理：