96和24孔板拍照和图象采集是正常的事,一般的细胞生物实验室都可以,倒置相差显微镜一般是OLYMPUS-IX71,或WEST GERMANY的DMIL
96和24孔板是塑料的不适合做组化实验
石蜡切片做TUNEL是否可以同时做免疫组化（同一张片上）
zhangji99：石蜡切片做TUNEL是否可以同时做免疫组化（同一张片上） birdegg：可以,用不同的显色系统就可以了.
ljksbs：建议：最好是两种方法做两张片子，不要图懒省事，做不好，就会对结果有影响！
关于石蜡组织切片用tunel荧光标记检测凋亡
uniquezy：我做动物实验对最后的肿瘤组织，用石蜡切片用tunel法检测肿瘤细胞的凋亡。根据说明书我的步骤如下：
1、石蜡切片脱蜡至水
2、我没有复合消化液、蛋白酶K所以我用胰酶消化的。1-2分钟 3、PBS冲洗三遍 2min/遍，将多余液体流干。
4、在切片上加入Tunel混合反应液约50ul/张，在湿盒内37度避光反应60min。 5、PBS洗三遍 5min/遍
6、荧光显微镜观察。但结果不是很理想非特异性染色很多。我又查阅了一些文献。他们用微波处理: 0101 mo l?L - 1枸橼酸盐缓冲液, pH 610, 至微波中加热92℃～ 98℃之间, 持续10 m in, 微波功率为800W;代替了酶消化，有的文章说蛋白酶消化好，有的说微波修复好，我感到很迷惘，而且我想知道修复的目的是什么，是让用多聚甲醛交联的抗原暴露吗？
我的非特异性荧光很多，是不是没有封闭内源性DNA酶: DEPC (diethyl2pyrocarbonate) 水洗, 室温放置30 m in。
另付一张阳性结果图，请高手指教。
（图片见http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1629472&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1629472）
yueh1：非特異性染色最常見的原因是反應過程中乾掉, 尤其是當組織面積較廣時,即使你放在濕盒中,還是可能有部分區域的液體過度濃縮(雖然看起來仍潮濕).這種情形在螢光染色尤其明顯, 在反應過程中你可以用較厚的塑膠膜輕輕覆蓋組織, 面積略大於組織面積即可.
我以前是採用試劑組做過, 並沒有用到你第6點中所提及的處理, 效果仍然不錯,不過我是用20ug/ml 蛋白酶K處理20min, 你用胰酶消化1-2min, 除非是有人報告過可以使用, 否則不建議這樣嘗試.
另外清洗用的PBS我們一般都會加入0.05% Tween 20來增強其清洗效果. uniquezy：你在做的时候有没有封闭内源性的DNA酶？我查阅的文献是用DEPC (diethyl2pyrocarbonate) 水洗, 室温放置30 m in。不知yueh1兄有没有用过。在反应过程用较厚的塑胶膜仅盖住组织可以防止干燥？还是用塑胶膜或者保险膜吧切片保住？
yueh1：我做的時候並没有特別封闭内源性的DNA酶, 但如果能增加這樣的處理, 應該效果是會更好.
較厚的塑膠膜僅蓋住組織就可以防止乾燥, 但至少蓋的要超過組織外緣, 蓋的時候傾斜輕輕蓋下以防止氣泡, 並要避免反應液溢出, 為了實驗過程中較易取下塑膠膜, 可以在蓋上之前先把一小角折起.
蓋塑膠膜的目的是減少和空氣的接觸面積(只剩下塑膠膜的邊緣), 還可以節省反應液的用量, 如果你把切片完全包住, 反應液沿整個包覆的面積滲透, 會使反應液在組織上的厚度大幅變薄, 反而不利反應的進行.
uniquezy：我想我把封口膜用作较厚的塑料膜应该可以是吧？ 1.试剂配制
①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0) 10mmol/LEDTA 150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.
请问你的蛋白酶K消化液是这么配制的吗？20ug/ml 蛋白酶K浓度可以吗？您是如何洗得，是将切片放入洗液中然后放在摇床上，还是只把切片放在洗液中就可以。
yueh1：依照 Boehringer 公司操作手冊的建議,
蛋白酶K的stock solution是用水配成10 mg/ml, 建議配好之後最好一每次預估用量先行分裝後再冷凍, 酶類的東西如果重複解凍, 其效能會大幅降低。其 working solution 配製是以TES [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA, 10 mM NaCl].
對於一般石蜡切片以 20ug/ml 的濃度處理即可, 但對於以 paraformaldehyde 固定或固定時間過久的組織則需要較高的濃度, 使用濃度範圍為10-500ug/ml.
清洗的方法並不拘, 只要能達到目的即可, 量少時可以一片一片的慢慢拿起來沖, 要是量多時可以第一次先沖掉反應液後, 放在染色專用的金屬架上整批用浸的方式上下沖洗.
zlepo: 本人正在用大鼠全脑石蜡切片做TUNEL，步骤如下：
1.脱蜡水化：二甲苯12ｍｉｎ，100％乙醇2ｍｉｎ，95％乙醇2ｍｉｎ，90％乙醇1ｍｉｎ，80％乙醇1ｍｉｎ，７０％乙醇1ｍｉｎ
2.蛋白酶K37度30ｍｉｎ 3.PBS漂洗3次５ｍｉｎ
4.滴加反应混合物（试剂一 5微升，试剂二 45微升）３７度1ｈ 5.PBS漂洗3次５ｍｉｎ
6.滴加试剂三 50微升 ３７度30ｍｉｎ 7.PBS漂洗3次５ｍｉｎ 8.滴加DAB显色
但做过很多遍了，都没有染上色，不知是什么原因？
Nevin: 不知你用的是哪家公司的试剂盒，我也在用TUNEL 检测淍亡，而且很巧我用的也是大鼠全脑石蜡切片（我是MCAO模型的），可能我比你幸运，我当时是一预试就成功的。针对你的步骤，我提一些意见，供你参考:
1、未知你脱蜡水化彻底否，我是这样的：Deparaffinize sections in 2 changes of xylene for 5 minutes each, and hydrate with 2 changes of 100% ethanol for 5 minutes each, and 90% ethanol for 5 minute, 80% ethanol for 5 minute, 70% ethanol for 5 minute.
2、蛋白酶K37度30ｍｉｎ，好像有点偏长，我是10ｍｉｎ。
3、TdT反应步骤我是2小时。而且之前最好加一步： 3% H2O237度孵育 30 minutes to block endogenous peroxidase activity。
4、还有你的反应液是不是新鲜配的，而且要新鲜配后置冰浴中保存备用。这也是一关键。
小问题是：你的DAB是即用型的还是要配的，建议用即用型的，以免失败在小环节上。 心肌缺血再灌的凋亡免疫组化的几个问题
reaction：我准备做大鼠离体全心缺血再灌的凋亡检测。听说心肌的凋亡Tunel不好检测，杭州联科生物技术有限公司的Tunel试剂盒说心脏组织细胞数多，破膜困难，使用两个破膜剂，不知怎样配？丁香园的参考说：蛋白酶K20ug/ml，室温15分钟，我看做心肌的文章用这个浓度的凋亡指数多不高，是不是破膜困难？若没有两个破膜剂，用50ug/ml的蛋白酶K37度15分钟是不是较理想，因为我发现用此剂量的文章的心肌凋亡指数比较高。博士德的Tunel试剂盒蛋白酶K够此剂量吗?
文献上凋亡的计算方法多为：光镜下200倍放大，经图像分析仪随机选择10个视野，检测阳性染色平均光密度(MOD)、阳性表达面积率(阳性核总面积占视野中所有细胞核总面积百分比)计算：细胞凋亡指数(AI)：AI(%)=MOD×表达面积率×100。也有的文章不乘平均光密度，直接算核的百分比，哪一种更科学？另外我看讲究的文献还要用相邻切片HE染色来确定排除内皮细胞和成纤维细胞，或用抗心肌结蛋白的抗体进行双标，若上两方法我都无法实现，文章的份量会受影响吗?
还有因经费紧张，Tunel每组做6张切片，每只大鼠做一张，可以吗？
心肌石蜡切片的Bcl-2文献多用1：100的一抗浓度，我已经用晶美的Bcl-2 1:70 染了几张DAB显色的石蜡切片，bcl-2蛋白的在85％以上的缺血再灌组心肌表达，肉眼看不出保护性药物组与缺血再灌对照组的区别，感觉是肌纤维的非特意性染色。是不是一抗浓度太高，抗原修复过了？请告诉我bcl-2与bax的浓度，孵育时间。
happypeng1193：4 μm石蜡切片常规脱蜡至水， PBS洗 3×3min
3%H2O2处理， 20min，室温 蛋白酶K 20μg/ml 20min 37℃ PBS洗 3×3min Tunel混合液
A液: 1ml TDT Buffer×1+10μl TDT B液：10μl biotin-dNTP
A、B二液混合，30μl/每片 37℃ 1h PBS洗 3×3min
Streptavidin-HRP 1:200 37℃ 30min PBS洗 3×3min
0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min，水洗 苏木素衬染1min，水洗蓝化 吹干后常规树脂封片
观察：凋亡指数（apoptosis inde×，AI）在普通光镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。
其他