（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。
（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。
3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。
5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。
6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。 9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。
11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。
（三）注意事项
一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。
用流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡各有何优缺点
xiaobang1979：请教：用流式细胞仪检测细胞凋亡结果可靠吗？是不是还需要做TUNEL法检测证实吗？还是二者结合更好？
midas：细胞凋亡的金标准是电镜。
其他方法如TUNEL法、流式等都是可靠的方法，但是最好是两种以上结合验证凋亡。 两种TUNEL检测应如何选择
hongbin9179：现在我手头上有两种TUNEL的方法（我要观察的是贴壁动物细胞）， 一是用荧光素标记d-UTP,TdT介导酶反应，然后用AP或POD作为报告酶标记的荧光素抗体结合已结合在DNA上的荧光素，最后用光线显微镜观察结果；
二是冷泉港细胞实验手册介绍的方法，用地高辛标记d-UTP，酶反应结合上DNA后用辣根过氧化酶偶联的抗地高辛结合地高辛，在加入DAB底物和过氧化氢。
请哪位大侠说一下哪个方法较灵敏，而且除了能用光线显微镜观察结果外，假如要用流式细胞仪时在试剂上无需改动太大的？本人第一次做这一类实验，经验不足，请有识之士帮帮忙。
midas：两种方法灵敏性均可以，第一种更方便一些。
流式细胞仪检测凋亡时的试剂一般是：PI-hoechst，或 PI-Annexin-V
liufaquan：第一种方法较好，因为荧光照片比较漂亮，容易简单。第二种方法主要地HRP的DNA染色，背景不好控制容易出现假阳性。
TUNEL假阳性高怎么办
jingr: 家兔主动脉血管石蜡切片，做TUNEL,DAB染色，有的片子阳性率竟然达到50％，不可能的。
woozson: 假阳性高是TUNEL检测的一个主要缺点。观察TUNEL阳性片是应对照HE切片。结合细胞HE染色来判断阳性的细胞究竟是假阳性还是真正发生了凋亡。凋亡细胞HE形态：细胞固缩，核染色质边集，但细胞膜完整，形成凋亡小体。
为什么我的TUNNEL做出来都是阳性
milaosul：我做了TUNNEL方法测凋亡,结果出来两组皆很强的阳性,与预期不一样,请问为什么
zmy1114：能不能把图附上，把你的实验步骤简单的描述一下。同时应该做一下空白对照和阳性对照，这样才能分辨你做的是真阳性还是假阳性。我们实验室一开始有人做免疫组化的时候就没有做空白对照，DAB显色后是有棕色颗粒，以为出来了，结果实验快做完了，补了一张空白对照，和自己的阳性结果一样。空白对照片就是不加一抗，而用PBS代替，其他步骤都一样。阳性对照片就是找几张肯定有你这种抗体表达的组织片来做一下。再有就是你在洗涤的过程中应该时间长一些。
milaosul：我的图片实验室拍照片程序有点麻烦,没有现成可以拍照片的地方.我 已经电话博士得公司,说这次TUNNEL加抗体标记后37度只能孵育一小时,我照着说明书处理两小时
中共党员：你的试剂盒可以买promage 的40人份2800元左右，可能效果会好一点。国产的，呵呵，有点不可靠
Nevin：我也正好在用tunel作有关apoptosis的研究，体会如下： 事实上，tunel的假阳性是很多的，因素也是很多的，如：
1) 固定液的性质和成分；2）组织块的大小和固定时间；3）AR的方法与你的处理时间等等
另外，一些有基因转录活性的非淍亡细胞也会呈tunel阳性。 所以，tunel检测apoptosis最好要结合形态学特征才比较可靠。
最后，假阳性特别要提一下固定液，固定液的浓度过高可造成组织边缘的迅速固定，从而影响液体的穿透，致使待固定组织的中心固定不佳－－－－－可以导致组织中心的cell自溶、DNA链不规则断裂，这就能致假阳性。
关于TUNEL试剂盒 zyj12321:
E-Mail: yu.an@roche.com For Technical QuestionsOnline Questions Apoptosis Product Name：in Situ Cell Death Detection Kit, AP
Description Catalog # Pack size Price Qty Options 1684809 1 kit (50 tests) 电话021-62790888
In Situ Cell Death Detection Kit, AP 原位细胞凋亡(程序死亡)检测试剂盒，碱性磷酸酶
规格价格￥ 50~100T 5,016.00 内容介绍：
细胞死亡有两种不同的方式：凋亡和坏死。两者可根据死亡细胞的形态、生物化学改变等的不同而加以鉴别。程序性细胞死亡或凋亡，是真核细胞死亡最常见的形式，它是保持体内平衡的一种生理性自杀机制，是正常组织更新过程中自然发生的细胞死亡。一般说来，凋亡细胞出现胞核和胞浆结构上具有特征性的改变，包括胞浆膜的快速起泡和核裂解。核崩解与染色质的广泛损伤不伴随DNA的裂解的情况是极为少见的。凋亡在许多生理过程中包括免疫系统成熟和效应机制,组织、器官和四肢胚胎发育、神经系统的发育以及激素依赖的组织重塑等都是必需的。在诸如缺血、中风、心脏疾病、癌肿、AIDS、自身免疫病、中毒性肝病和中枢神经系统的退行性变等疾病中，凋亡的不适当的调节起着重要的作用。各种抗癌药物、放射和高温都可以触发凋亡；肿瘤细胞对凋亡的敏感性受几种癌基因表达的调节；凋亡可能是癌症治疗的一种预后标志，肿瘤学上所观察到的这些凋亡现象已引起人们广泛的兴趣。
已有许多方法可用来检测凋亡细胞。据认为核酸内切酶介导核溶解作用在细胞凋亡中是关键的生物化学事件，它引起核DNA的裂解，形成核小体大小的碎片。因此，凋亡在琼脂糖凝胶电泳表现为典型“DNA梯子”，不过这种方法不能提供有单个细胞凋亡信息，亦不能提供有关细胞凋亡与组织学定位或细胞分化的关系。
凋亡可以通过诱导DNA单链断裂、酶原位标记方法来检测。DNA聚合酶以及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记核苷酸原位掺入并结合到DNA断裂点上。与应用DNA聚合酶
的原位缺口转移(ISNT)比较，TdT末端反应亦称为原位末端标记(ISEL)或称末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术，具有如下优点：
凋亡细胞的标记强度，TUNEL比ISNT更高，敏感性增加。 核苷酸掺入上，TUNEL比ISNT快得多。
TUNEL优先标记凋亡细胞而不是坏死细胞，因此可以识别(分清)哪些是凋亡细胞，哪些是坏死细胞或由抗肿瘤药物或放射诱导的DNA链断裂。
原位细胞凋亡检测试剂盒对于测定细胞和组织中凋亡细胞具有精确、快速、简单、非放射反应等优点，因此该试剂盒适用于许多不同检测系统，例如：
在基础研究和常规病理中的冰冻和福尔马林固定组织切片中检测单个凋亡细胞 在癌症研究和临床肿瘤学方面，检测癌细胞对凋亡诱导药物的敏感性 通过双重染色方法，在异质群体中，检测死亡细胞的类型 试剂盒成分：
1#瓶：酶溶液----末端脱氧核苷酸转移酶TdT(10x) 5 x 50ul 2#瓶：标记溶液----核苷酸反应液(1x) 5 x 550ul
3#瓶：酶标抗体----酶标记的抗荧光素抗体 ready to use，3.5ml yuhaibo:有谁用过北京中山的TUNEL试剂盒，不知效果怎么样? yanjingfeng519: 效果可以.是国外试剂分装的.
yuhaibo: 那么它10人份的盒子，你们就只能用10次么，还是可以多用几次，我想做细胞，不太了解此盒子的特性，所以还没有决定用它。
cheungsober: 效果同国外的差不多,是进口分装的,10人份的,可以用8-9次,10次危险,不过有时后你发现不了典型的小体,复染很重要,作细胞的则应考虑设置阳性对照
yuhaibo:好象有些液体还要自己配备，是么？
newfish: 是的比如说据盐酸钠等我们10次的用了20次也没事