浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 9 页 共 32 页 同时给患者2 个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。
二、疗效评价：凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰：
（一）初次涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3 个月和继续结束时，复治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3 个月和继续期结束时，各查一次晨痰。
（二）初、复治涂阳患者在疗程强化期接受时，痰菌仍为阳性者，应在1 个月时增加晨痰检查一次；若复治涂阳患者治疗满 3 个月时痰菌仍阳性，应在治疗满 5 个月增加晨痰检查一次。
（三）确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满 2和6 个月时进行痰菌检查。 第四节 痰标本的采集 一、标本采集：
（一）用于采集标本的容器：采用 WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶（见图 2 ），或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4cm ，高 2cm ）。痰容器上应标明病人的姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目、容器序号1、2 、3 （1 ＝当日即时痰，2 ＝夜间痰，3 ＝次日晨痰）。 （二）标本的性状：
合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。 1 、干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可见大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 10 页 共 32 页 咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB 的检出率较高。 2 、血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中还可见到被染色的红细胞。由于含血标本易干扰AFB 镜检的结果，故在制片时 应尽量避免挑取含血标本。
3 、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多 数为圆形，细胞核较小，且着色较细胞质深，核质比＞1:3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比＜1:1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB 检出率较唾液高。 4 、唾液：目视观察标本外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核 着色较细胞质深，核质比接近或＞1:2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标 本进行AFB 检查时的检出率很低，用于患者确定诊断时是不合格的标本。
（三）标本采集：
根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类： 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液。
晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2 口、第3 口痰液。 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 11 页 共 32 页 进行AFB 检查的医疗机构应提供符合要求的标本收集容器，医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检查项目、痰标本序号，然后交给患者。对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。（注意：由于当患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。） 患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）：标本量一般在3～5ml ，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时，应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。
第五节 涂片抗酸染色检查方法
抗酸染色的基本原理：抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状，此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。
一、玻片的制备：
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 12 页 共 32 页 （一）用于AFB 检查的载玻片要求： 1. 一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。
2. 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于 AFB 涂片检查；
3. 应使用以95% 乙醇擦拭（浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片制备涂片，在玻片背面一端的 1/3 处注明实验室序号及标本序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用 2B铅笔在磨砂面上直接书写）。
（二）制备涂片：小心打开留取痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢（最好在超净工作台中操作）。仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05 ～0.1ml，于玻片正面右侧 2/3，处均匀涂抹成 10mm×20mm 的卵圆形痰膜。痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约需要30 分钟）进行染色镜检。 涂抹完毕后的痰标本，在报告结果前应暂时保留。为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻片进行加热。
二、萋尔－尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson ，Z-N ，简称萋－尼氏染色）：
（一）试剂的配制 1 ．石炭酸复红染液： （1 ）储存液
① 碱性复红液：碱性复红 8g，加 95% 乙醇至100ml ，充分振荡使复红溶解。 碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过 6 个月。
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 13 页 共 32 页 ② 5% 石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸 5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml 。
（2 ）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液 10ml与5%石炭酸水溶液 90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。 碱性复红（或称为碱性品红，basic fuchsin，or pararosaniline chloride，分子式为 C 19 H18NCl）用于AFB 染色时，必须使用染料最低含量超过88% 的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。如果标注的染料含量低于88% ，则在配制时需调整称取量。例如，染料含量标注为75% 的产品，配制 100ml 储存液时实际的称取量应是8/0.75=10.7g。
石炭酸（苯酚，phenol ，分子式为 C 6 H6 O）:应使用熔点为40.5 ℃的分析纯试剂。
2 ．5%盐酸乙醇脱色液：35% 浓盐酸 5ml 与95% 乙醇95ml混合。 3 ．亚甲蓝复染液：
（1 ）储存液：亚甲蓝 0.3g 溶于95% 乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml 。
（2 ）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06% ，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。亚甲蓝（methylene blue chloride，or methylthionine chloride ，分子式为 C 16 H18 ClN3S）：染色时必须使用染料含量超过82% 的生物染色剂。 4 ．萋－尼氏染色步骤：
1. 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm 以上