浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 14 页 共 32 页 的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4 次）。 2. 滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 分钟。染色期间始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。
3. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 4. 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
5. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 6. 滴加亚甲蓝复染液，染色30 秒钟。
7. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。 一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。 三、镜检读片：
（一）萋－尼氏染色玻片镜检
使用 10 ×目镜双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40×物镜，在玻片上滴 1 ～2 滴镜油，使用 100×油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止AFB 的交叉污染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。 由于香柏油（cedarwood immersion oil）能溶解复红染料，使萋-尼氏染色退色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害，故推荐使用专门用于100×油镜、不干燥、不变硬的镜油（immersion oil ）。
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 15 页 共 32 页 读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mm ×20mm 的痰膜，使用100×油镜，每行可观察约100 个视野。仔细观察完300 个视野，一般需要 5 分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不要超过25 张，且连续阅读 10～12 张玻片后，应休息20 分钟左右。 四、镜检结果报告：
由于与疾病传染性的程度及其相应严重程度密切相关，故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。 （一）萋－尼氏染色镜检结果分级报告标准：
抗酸杆菌阴性（－）：连续观察300 个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：1 ～8 条/300 视野。 抗酸杆菌阳性（1+）：3～9 条/100 视野。 抗酸杆菌阳性（2+）：1～9 条/10 视野。 抗酸杆菌阳性（3+）：1～9 条/ 每视野。 抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/ 每视野。 五、抗酸染色玻片的保存：
阅读完萋－尼氏染色玻片后，应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。
六、痰涂片抗酸染色检查注意事项 （一）AFB 痰检假阳性结果的预防措施
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 16 页 共 32 页 1. 必须使用新的载玻片进行痰涂片检查。 2. 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。 3. 所有染液均经过过滤。
4. 染色时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开。 5. 严禁使用染色缸将玻片放置一起染色。 6. 染色时勿使玻片上的染液干燥。
7. 滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。 8. 严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜。
9. 完整、准确的标注痰盒、玻片和实验室登记本的各项内容。 10. 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 11. 准确记录和报告结果。
（二）AFB 痰检假阴性结果的预防措施 1. 确认标本是痰而非唾液。 2. 确认每份标本至少有 3 ml 。
3. 选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。 4. 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 5. 使用高质量染料、严格按照配方配制染液。 6. 严格按照操作程序完成染色过程。
7. 判断结果为“阴性” 前，必须阅读规定要求的视野数。 8. 作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。 9. 完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。 10. 登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 11. 准确记录和报告结果。
第六节 涂片抗酸染色检查材料管理
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 17 页 共 32 页 一、显微镜日常维护
显微镜作为发现涂片阳性病人的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予正确维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点：
1. 显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。 2. 使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。 3. 严禁物镜镜头直接接触玻片上痰膜。 4. 使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。
5. 使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。 二、AFB 镜检耗材管理:
为保障痰涂片检查工作能够连续不断开展，应储存一定数量的实验耗材和相应试剂，储备量可根据既往每季度工作量来进行评估，一般应准备比平均工作量高20% 的相应耗材和试剂。参考文献： 1. 《全国结核病防治工作手册》，卫生部疾病控制司、卫生部医政司编，1999。
2. Technical Guide. Sputum Examination for Tuberculosis by Direct Microscopy in Low
Income Coutries.5th edition,IUATLD,2000.
3.The Micoscope.A Practical Guide.WHO Project:ICP TUB 001.New Delhi, India:WHO
Regional Office for South-East Asia,1999.
4. Laboratory Biosafety Manual.2nd edition.Geneva:WHO,1993:60-61.
浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 18 页 共 32 页 第三章 痰涂片实验室质量保证
按照世界卫生组织（WHO）和国家结核病防治规划（NTP ）的要求，在我国已全面推行DOTS 策略或DOTS 策略得到良好贯彻执行的地区，为了持续提高结核病实验室痰涂片检查的工作效率和可靠性，必须建立我国结核病实验室质量保证系统网络，在实验室内部质 量控制的基础上，应用实验室间质量检查和评估方法，进行实验室检查系统的评价，并通过采取一系列措施改经和不断提高实验室业务总体水平。
第一节 室内质量控制
室内质量控制（Quality Control ，QC）是指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告、以及痰片保存等整个过程中的内部检查和监测。 一、痰标本收集
（一）容器：采用 WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集标痰本（参考规格：直径 4cm ，高度 2cm ）。痰容器应标明病人姓名、日期、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）和容器序号1 、2 、3 （1 ＝当日即时痰，2 ＝夜间痰，3 ＝次日即时痰）。
（二）痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。