无菌水
10× PCR缓冲液（含Mgcl2）
dNTP混合物 上游引物 下游引物 待扩增DNA模板 Taq DNA聚合酶（5 U/μl）
终体积
17μl 2.5μl 2μl 1μl 1μl 1μl 0.5μl 25μl
混匀后，稍作离心（如果利用非热盖型PCR仪器，应添加30 μl石蜡油于反应管中，防止样品水分的蒸发）[17]。将反应管放入PCR仪，按下列条件设定反应程序，进行PCR反应，如表4：
表4 PCR反应过程
94℃预变性 5 min 变性 94 ℃ 30 s
退火 55 ℃ 30 s 循环25次
延伸 72 ℃ 30 s 最后在 72 ℃ 保温10 min
PCR 反应结束后，取5-10 μl反应液做电泳检测，鉴定PCR 反应产物是否存在，及其大小。电泳确认后，PCR 产物即可用于下一步操作或冰箱保存。
2.2.10 目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE检测 2.2.10.1 目的基因的诱导表达
重组菌的扩增：接种转化了pET-28a-hEGF的Ecoli DE3于含Kana (50μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃，200 rpm，振荡培养过夜。转接100μL过夜培养物，
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于100mL的LB液体培养基，于37 ℃ ，200 rpm，振荡培养至OD 600值在0.7-1.0。从中取出1.0 ml菌液，离心，弃去上清，40 μL PBS悬浮，备用于后面SDS-PAGE 电泳操作。
重组菌外源基因的诱导表达：向扩大培养的培养基中加入1000 μL 0.1mol/L IPTG(至终浓度1 mmol／L)，于37 ℃振荡培养3-4h。
蛋白样品的抽提：将诱导后菌液，4.0 ℃，5000 rpm/min，离心10 min，弃去上清。将所得的菌体沉淀，用PBS溶液悬浮，并转移到10 ml离心管中，向管中继续加入PBS至适宜采用超声破碎仪破碎为止，大约5 ml。用移液器吹打，充分悬浮细胞后，将离心管放到盛有的冰块的烧杯中。清洗并擦拭超声破碎仪的金属杆，然后将超声破碎仪的金属杆插入到离心管中，调整好位置，关上超声破碎仪的门，打开电源，设置程序，开始对细菌经行超声破碎[17]。破碎设置：功率400 W左右；工作2 s；间隔8 s；破碎时间10 min。破碎处理后的细菌细胞，10000 rpm/min 离心10 min。取出离心管，吸取上清液至新的离心管中，此即为所抽提的蛋白样品，可用于后续操作[17]。把离心的沉淀用40 μL PBS悬浮，亦备用于后续SDS-PAGE 电泳操作。
2.2.10.2 SDS-PAGE 电泳检测
1.分别将未诱导前的菌体悬液、诱导破碎后的菌体上清和诱导破碎后的沉淀悬浮液分别和一部分过柱纯化洗脱好的蛋白与5×上样缓冲液按4:1混匀于微量离心管中。
2.将上述四个微量离心管插入水漂，沸水中煮5 min。然后立即插入冰中。样品冷却到室温，5000 rmp 离心5 min。
3.按要求组装电泳装置，并验漏。 4. 配制分离胶及浓缩胶：
根据目的蛋白的分子量大小，选择合适的凝胶浓度。不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围，如表5： （1）SDS-PAGE分离胶，如表6：
配制12% 分离胶，按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液，在50 ml的小烧杯中混合（注意Tris 为pH 8.8）。
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蛋白质分子量范围（KD） 适宜的凝胶浓度（%） ﹥100 30-100 10-30 ﹤10 8 10 12 15 表5 SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围
体系组成 双蒸水 30% Acr-Bis（29:1）（ml） 1.5M Tris-Hcl，pH8.8（ml） 10% SDS（ml） 10%过硫酸铵(AP)溶液（ml） TEMED（μL） 总体积（μL） 体积 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 4 10 表6 SDS-PAGE分离胶反应体系
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体系组成 双蒸水 30% Acr-Bis（29:1）（ml） 1.0M Tris-Hcl，pH6.8（ml） 10% SDS（μL） 10%过硫酸铵(AP)溶液（μL） TEMED（μL） 总体积（μL） 体积 2 0.5 0.5 40 30 4 3 表7 SDS-PAGE浓缩胶体系 加完试剂后，拿起烧杯轻轻晃动底部，将溶液混匀后，立即用1000 μL移液器，缓缓把胶液注入玻璃夹缝，每次余部分胶液于枪头内，以免产生气泡。然后在上界面用200 μL移液器轻轻地沿玻璃壁均匀地加蒸馏水，从左到右，以免造成胶面不平整，两液面的交界处呈波浪形，然后静置30 min。倒出蒸馏水，并倒置玻璃装置，尽可能把水倒尽，然后用滤纸吸去残留的水。 （2）SDS-PAGE浓缩胶：见表7。
配制5% 分离胶，按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液，在一个50 ml的小烧杯中混匀（注意Tris 为pH 6.8）。
加完后，拿起烧杯轻轻晃动，将溶液混匀后，立刻用1000 μL移液器缓缓注入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20 min。 5. 小心地垂直拔出梳子，用蒸馏水冲洗加样孔2次，然后用滤纸吸干。电泳槽的上部倒满电泳缓冲液（约250 ml，淹没过加样槽的液面），电泳槽的下部倒入
【19】
一半电泳缓冲液（约180 ml）。
6. 选取形态好的加样孔，在一张空白纸上做好对应的标记，用微量移液器在靠边缘的一个加样槽中加入5 μL蛋白Marker，其它槽中加入30 μL自己制作的样品。
7. 接好电极，将电压调至80 V,待溴酚蓝移到分离胶后，再调电压至120 V，电泳约2 h。期间注意观察电泳槽上部的电泳液是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）。当溴酚蓝移到距底部≤ 0.5 cm时，切断电源。 8. 在一个大的培养
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皿里，准备适量的考马斯亮蓝染液。 9.倒掉电泳槽中的电泳液，取下玻璃板，用刀片轻轻撬开，用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序【19】。然后用水稍微冲一下玻璃板，戴手套用梳子小心地把分离胶从玻璃板上剥离到培养皿中，盖上盖，在脱色摇床上染色45 min。 10. 染色后，将染液回收，以备重复使用。在培养皿中加脱色液Ⅰ，摇床上脱色45 min。倒掉脱色液Ⅰ，更换为脱色液Ⅱ，摇床上脱色45 min。更换新的脱色液Ⅱ，脱色摇床上脱色过夜，至大部分蓝色褪尽。 11. 观察脱色后电泳胶中的蓝色带纹。对照、寻找异常粗的带纹，并比较其分子量，判断是否为预期目的基因的产物。
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