第三节 EGF表达蛋白的纯化与检测
--------镍离子金属螯合亲和层析
3.1 实验原理
金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography)，其纯化原理是：组氨酸（His）的侧链带有1个咪唑基团,咪唑基团pKa值在6左右,在pH＞7的条件下,咪唑基团带负电,容易与Ni2+离子结合，尤其是带有6个组氨酸（6xHis）标签的重组蛋白对Ni2+离子具有极好的亲和力。通过介质固定Ni离子能够选择性地纯化含有多个组氨酸的蛋白以及多肽；吸附在Ni2+离子上的蛋白可以使用咪唑进行竞争洗脱分离。
常用于Ni2+离子金属螯合亲和层析的介质为NTA（Nitilotriacetic acid）。镍离子有六个螯合价位， NTA螯合了四价，剩余两价与蛋白质上的组氨酸结合（如下图所示）。
3.2可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法
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3.2.1缓冲液配制（使用0.45 μm滤器过滤） ①. 缓冲液A（平衡缓冲液）：1 L 20mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g 500mM NaCl 29.2 g 20mM Imidazole 2.04 g 用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至1 L。
②. 缓冲液B（洗脱缓冲液）：0.5 L 20mM Na2HPO4.2H2O 1.78 g 500mM NaCl 14.6 g 500mM Imidazole 17.02 g 用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至0.5 L。
3.2.2 样品制备
①. 菌体收集：5000转/分钟离心10分钟，收集菌体，弃上清液；
②. 菌体重悬：加入10-20 ml的缓冲液A（每升培养液约加15 ml），通过震荡
充分悬浮细胞；
③. 超声波破碎：将细胞混悬液置于一个合适的小烧杯（也可用其它合适的器皿）
中，在冰上超声波破碎（约500 W，破 2s 停 2s，总时长15分钟）； ④. 菌体破碎后，13000转/分钟离心30分钟，收集上清液（弃沉淀），使用0.45
μm 滤器过滤后用于镍柱纯化（取10 μl样品用于之后的SDS-PAGE检测）。 3.2.3 Ni-NTA预装柱纯化6xHis重组蛋白
①. 取一根Ni-NTA预装柱（1 ml），分别用10 ml三蒸水和10 ml缓冲液A洗涤
柱子，流速为1-2 ml/min；
②. 将过滤好的细胞上清液以0.5 ml/min流速上样到镍柱中（期间，取10 μl穿
柱液样品用于之后的SDS-PAGE检测）；
③. 用15 ml缓冲液A洗去未吸附的样品，流速1-2 ml/min；
④. 用5 ml缓冲液B洗脱重组蛋白，流速1 ml/min，1 ml/管收集洗脱液（将每
个收集管编号并每管取10 μl样品用于之后的SDS-PAGE检测）；
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⑤. 用5 ml缓冲液A再次洗涤柱子 ⑥. 用5 ml三蒸水洗涤柱子；
⑦. 用2 ml20%乙醇洗涤柱子，封闭，以备下次使用。
注：此方法是通用的方法，但是未必能得到较好的纯化效果，可选择使用咪唑浓度梯度进行洗脱（如分别含有50 mM，100 mM，300 mM，500 mM咪唑的缓冲液B）或者使用?KTA蛋白纯化系统进行更为精确的梯度洗脱。
3.2.4 SDS-PAGE检测纯化效果
配制10-15%的SDS-PAGE,对上述收集的样品进行检测；根据检测结果，将重组蛋白纯度和浓度较高的收集管中的样品标记保存。 3.36xHis重组蛋白包涵体纯化与复性
某些重组蛋白在表达的过程中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键（一级结构正确，高级结构错误），从而水不溶性且致密地集聚在细胞内，这种形式称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。包涵体主要含有重组蛋白，但同时含有一些细菌成分，如核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、质粒DNA、以及脂体、脂多糖等。
较强的变性剂如尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M）通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种次级键，使多肽伸展而溶于水中。如果重组蛋白是以包涵体的形式表达，则将包涵体变性溶解后（加入 >=6 M盐酸胍或 >=8 M尿素）进行镍离子金属螯合亲和纯化。此纯化过程与可溶性6xHis重组蛋白的纯化方法相同，只是在缓冲液A和B中都加入同样浓度的变性剂（6 M盐酸胍或8 M尿素）。要得到有活性的重组蛋白，必须对纯化得到的变性重组蛋白进行复性，但复性过程的收率往往很低。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
包涵体的纯化通常包括包涵体的分离、洗涤、溶解、镍柱亲和纯化以及蛋白质复性等步骤（注：也可在变复性之后进行亲和纯化）。 3.3.1缓冲液配制（使用0.45 μm滤器过滤） ①. 包涵体洗涤缓冲液: 100 ml 20mM Na2HPO4.2H2O 0.356 g
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500mM NaCl 2.92 g 2 M 尿素 12 g 1 mM EDTA 0.03 g Triton X-100 (2%) 2 ml 用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至100 ml。
②. 变性缓冲液A（平衡缓冲液,也作为包涵体溶解缓冲液）：100 ml 20mM Na2HPO4.2H2O 0.356 g 500mM NaCl 2.92 g 20mM Imidazole 0.2 g 8 M 尿素 48 g 用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至100 ml。 ③. 变性缓冲液B（洗脱缓冲液）：50 ml 20mM Na2HPO4·2H2O 0.178 g 500mM NaCl 1.46 g 500mM Imidazole 1.7 g 8 M 尿素 24 g 用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至50 ml。
3.3.2 包涵体的分离、洗涤、溶解
①. 菌体收集：5000转/分钟离心10分钟，收集细胞，弃上清；
②. 菌体重悬：加入10-20 ml的包涵体洗涤缓冲液（每升培养液约加15 ml），
通过震荡充分悬浮细胞；
③. 超声波破碎：将细胞混悬液置于一个合适的小烧杯（也可用其它器皿）中，
在冰上超声波破碎（约500 W，破 2s 停 2s，总时长15分钟）；
④. 菌体破碎后，13000转/分钟离心30分钟，收集沉淀（弃上清液，沉淀为包
涵体）；
⑤. 包涵体的洗涤：加入10-20 ml的包涵体洗涤缓冲液震荡重悬包涵体，13000
转/分钟离心30分钟，收集沉淀（弃上清液）；
⑥. 包涵体的溶解：加入10-20 ml的包涵体溶解缓冲液（变性缓冲液A）震荡重
悬沉淀，室温搅拌（磁力搅拌器）5-6小时或过夜；
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⑦. 包涵体充分溶解后，13000转/分钟离心30分钟，收集上清液（弃沉淀），使
用0.45 μm滤器过滤上清液后用于镍柱纯化（取10 μl样品用于之后的SDS-PAGE检测）。
3.3.3 Ni-NTA预装柱纯化6xHis变性重组蛋白
此实验流程与2.3中可溶性重组蛋白的纯化方法一致，但使用变性缓冲液A和B分别代替2.3中的缓冲液A和B。
3.3.4 变性重组蛋白的复性
复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同，任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件。可加入复性添加剂，如还原/氧化型谷胱甘肽（10:1～3:1）、L-精氨酸或甘氨酸（0.5 M）以及分子伴侣（硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等）可能会提高复性的效率。
通常蛋白质复性的方法有：稀释复性、透析复性、超滤复性、亲和柱复性等。
透析复性：通过逐渐降低外透液中变性剂的浓度来控制变性剂去除速度。将亲和纯化得到的变性重组蛋白装入透析袋（透析袋的截留分子量视重组蛋白质的大小而定），在4℃下将透析袋浸入下列溶液依次透析。 以下均为1 L 透析液的配方。 20mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g 150mM NaCl 8.7 g 0.4M L-Arginine 69.6 g 4 M 尿素 240 g 溶液pH调节到7.5 透析24小时
20mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g 150mM NaCl 8.7 g
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