EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT CTTAA↑G TTCGA↑A
连接酶则是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。常用的T4DNA连接酶是在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的，需 Mg2+ 和ATP的存在才能发挥活性。它能催化两条匹配DNA链的3’－OH和5’－P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。
外源DNA就是需要克隆的DNA片断，一般有四种来源。（1）限制性内切酶切割DNA产生的片断，经电泳分离后回收获得；（2）大DNA分子经人工剪切产生的片断，这种片断一般是平末端；（3）cDNA，即与mRNA互补的DNA，由真核基因的mRNA逆转录制备；（4）人工合成的基因，例如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。
外源DNA分子与载体（质粒）经过相同的酶切可以产生相互匹配的粘末端或平末端，经DNA连接酶连接就构成了重组DNA分子（重组质粒）。质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌（受体细胞）的过程。这一步是实现重组克隆的增殖。
受体细胞要接纳外源DNA，必须处于感受态。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。
电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而使外源DNA能进入细胞，一般转化率为 109 ～ 1010 转化子 /μg DNA；对于热激法，是利用冰冷的 CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的 “感受态”，易于摄取外源DNA。转化率约106～ 107转化子 /μg DNA。
获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。由于载体都具有供筛选用的遗传标记，如抗生素，细胞转化后获得了这种遗传特性，使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。经过培养初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA，还需进一步对DNA进行分析。常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定，观察PCR产物的大小是否与目的基因大小相符；方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。
在确证得到核酸序列一致的基因后，接下来就要想办法使该基因得到表达，获得基因表达产物——蛋白（肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定。SDS-PAGE电泳不但能观察到蛋白在电场中的泳动位置，而且还能知道蛋白的分子量大小以及由几个亚基组成。此外，还可将电泳胶上的蛋白质条带转移到尼龙
6
膜上，以亲和反应或免疫反应来检测特异蛋白的存在，即所谓的Western Blotting。 在基因表达产物也得到确证之后，就可以对表达的蛋白（肽）进行发酵和分离纯化，并研究其生物学功能。
2 实验目的和要求
2.1 DNA重组技术实验目的和要求
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
2.1.1 提取基因工程中的运载基因的载体DNA，掌握最常用的提取和纯化DNA的方法。 2.1.2 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。并以此法进一步区分质粒DNA中染色体DNA和RNA的污染；估计出质粒DNA分子量的大小；观察质粒DNA三种基本构象的比例；也可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度，是基因工程实验中最常用的实验方法。
2.1.3 学习和掌握用紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度。
2.1.4 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法。了解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。 2.1.5 学习和掌握感受态细胞的制备过程。
2.1.6 掌握质粒的转化方法，学习把体外重组的DNA（即连接反应物）导入受体细胞（感受态细胞），使受体菌具有新的遗传特性，并从中选择出阳性转化子。
2.1.7 学习从转化子中筛选和鉴定目的克隆的方法，掌握菌落PCR和限制性内切酶酶切两种鉴定方法。
2.2蛋白质在大肠杆菌中的大量表达
2.2.1 了解外源蛋白质在大肠杆菌中大量表达的原理和技术。 2.2.2 了解蛋白质原核表达体系的构建原理 2.2.3 掌握表达产物检测原理
3实验材料和仪器
3.1实验材料：
菌种：大肠杆菌DH5α（含20%甘油的LB培养基-35℃保存） ；
大肠杆菌BL21（含20%甘油的LB培养基-35℃保存，已含加载有GLP-1基因的
重组质粒）
质粒：pUC19（Ampr）；pET32a 基因：λ噬菌体DNA；
7
3.2主要仪器设备：
超净工作台；恒温培养箱；恒温振荡器；恒温水浴锅；微波炉；低温冰箱； 台式高速离心机；漩涡混合器；分析天平；脱色摇床
稳压电泳仪；垂直/水平式电泳槽；紫外－可见光分光光度计；紫外检测仪；SDS-PAGE电泳系统
PCR扩增仪；凝胶成像分析系统 3.3实验器皿：
锥形瓶；试管；烧杯；量筒；三角推棒；培养皿；
tip头；Eppendorf管；微量移液枪（2μl－1000μl）；微量进样器（50μl或100μl）；一次性手套，牙签。 3.4细菌培养基：
LB液体培养基
蛋白胨 1.0％ 酵母膏 0.5％ NaCl 0.5% pH 7.5
固体培养基在上述液体培养基中再加入2％琼脂。将已经配制好的液体或固体培养基灭菌后（1.1公斤/ cm2，保温20分钟），加入100mg/ mL的Amp，使其终浓度为100ug/ mL。然后按需要分装。 3.5分子生物学试剂：
RNaseA溶液: 10mg/ mL，0.1M NaOAc pH 4.8, 0.3mM EDTA，80－100℃加热10分钟，自然冷却到室温，分装，－20℃保藏。
DNA Marker；限制性内切酶EcoRI或Hind III；λDNA（线状）；质粒纯化Kit；TaqDNA聚合酶，4×dNTP；引物
溶液I：50mM 葡萄糖；25mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA 溶液II：0.2N NaOH；1%(w/v)SDS
溶液III：5M KAc 60mL； 冰醋酸 11.5 mL； H2O 28.5 Ml
EDTA溶液（0.5mol/L，Ph8.0）：称取EDTA-Na2盐18.6g，先用70mL双蒸水溶解，然后逐渐加入10M的NaOH溶液，边加热边搅拌，同时不断测量pH值，至pH8.0为止，再加入双蒸水定容至100mL。
核酸上样缓冲液：50％蔗糖，0.2％溴酚兰溶液
（1） TBE 缓冲液（Tris-硼酸）：89 mM Tris-硼酸；2 mM EDTA（pH8.0）。 （2） 50×TAE缓冲液（Tris-HAc）：0.04M Tris-HAc，1 mM EDTA（pH8.0）。 Tris 24.22g，用30mL水充分溶解，加5.7mL冰乙酸，再加入10mL EDTA（0.5mol/L，
8
Ph8.0），再用冰乙酸调pH至8.0，加水定容至100mL。
琼脂糖：按所需浓度称取，并用TAE缓冲液配制，微波炉或煤气加热熔化使用。 EB染液替代品：Goldernview 染料
氨苄青霉素（Amp）溶液: 100mg/mL，无菌水溶解
IPTG溶液：诱导用IPTG浓度为1mol/L；涂平板用IPTG浓度为20%（质量体积比），配好后-20 ℃避光保存
X-gal溶液：市售X-gal液体浓度为2%，使用时按需加入适量。 苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1（V/ V/ V） 70%冷乙醇（－20℃保藏）
酶：Hind III；T4 DNA连接酶；Taq聚合酶
普通质粒小提试剂盒（离心柱型）：TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO.,LTD 3.6 SDS-PAGE电泳试剂：
储备液
1．2M Tris-HCl (pH8.8),100ml 2．1M Tris-HCl (pH6.8),100ml 3．10%SDS,100ml 4．50%甘油,100ml 5．50%溴酚兰,10ml
工作液 A液：100ml
1．30%丙烯酰胺(29.2g) 2．0.8%甲叉双丙烯酰胺(0.8%)
加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶避光保存。 B液：100ml
1．75ml 2M Tris-HCl(pH8.8) 2．4ml 10%SDS 1． 21ml H2O C液：100ml
1．50ml 1M Tris-HCl(pH6.8) 2．4ml 10%SDS 3．46ml H2O 过硫酸铵，5ml
0.5g过硫酸铵溶于5ml 蒸馏水。 电泳缓冲液，1L 1．3g
2．14.4g甘氨酸
9
3．1g SDS
加蒸馏水定容到1L。
5×上样缓冲液，10ml 1．0.6ml 1M Tris-HCl (pH6.8) 2．5ml 50% 甘氨酸 3．2ml 10% SDS 4．0.5ml 2-巯基乙醇 5．1ml 1% 溴酚兰
染色液, 1L 1．1g考马斯亮蓝R-250 2．450ml甲醇 3．450ml H2O 4．100ml乙酸
脱色液，1L 1．100ml乙醇 2．100ml冰醋酸 3．800ml H2O
其它试剂均为国产分析纯
4实验内容
4.1 DNA重组技术实验内容 4.1.1载体的制备
从大肠杆菌中提取质粒作为运载外源基因的载体。并将提取到的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，观察质粒大小、构型和纯度。为作下一步的酶切，连接及转化试验，还必须测定DNA的纯度和浓度。将提取到的质粒用分光光度计检测 260nm、280nm 波长吸光值，可检测质粒纯度并根据吸光值计算出浓度。 4.1.2目的基因的制备
根据已知基因序列，设计两条引物，运用PCR方法扩增出目的基因片断。将扩增片断用琼脂糖凝胶电泳检测，用PCR产物回收Kit纯化PCR产物，为下一步酶切准备。注意，如果是真核基因，应该是用其cDNA序列进行克隆。 4.1.3体外DNA的重组（酶切与连接）
选择合适的两种限制性内切酶对供体（目的基因）和受体（载体）同时进行酶切，产生相匹配的粘性末端，再利用T4DNA连接酶将基因片段与载体连接起来，在体外构建成重组DNA分子。
4.1.4重组DNA分子引入受体细胞
10