制备大肠杆菌感受态细胞。将重组DNA分子转化入感受态细胞，抗性平板筛选并培养过夜观察。 4.1.5转化子的筛选
利用重组质粒的氨苄抗性和蓝白斑筛选法对转化子进行初筛。 4.1.6重组DNA分子的鉴定
采用菌落PCR法鉴定和限制性内切酶分析来进一步确定阳性克隆。或者通过DNA测序来直接检验。
4.1.7目的基因产物的检测
将阳性克隆发酵培养，若是诱导表达质粒，则加入诱导物进行诱导表达，然后用SDS-PAGE分析目的基因产物的大小与表达量等，若有合适抗体，还可直接用Western blotting检测目的基因是否表达。
4.2 蛋白质在大肠杆菌中的大量表达（略） 5思考题
1.实验小论文
以“×××基因的克隆和表达”为题，模拟一个来源于真核生物的基因在大肠杆菌中进行表达的实验论文。要求简单介绍欲克隆基因的背景知识，克隆策略及重组DNA分子筛选等内容。书写格式请参考《中国科学》杂志上相关文章格式。实验小论文中应包含如下内容：标题，摘要（中英文），关键词，前言，材料，方法，结果，讨论和参考文献等。
2.若实验室中已有的两种质粒为pUC19和pET32a，但由于未经标记 ，已经无法分辨，你会用何种实验方案鉴定这两种质粒？ 3．试剂盒提取质粒DNA的原理是什么？
4．除了EB，现在是否有更安全的核酸染料？GoldView核酸染料你了解吗？它的使用与EB有何不同？
6参考资源
6.1参考书目：
1. 分子克隆实验指南（第三版），科学出版社翻译版，2002 2. 基因工程原理（第二版）上册，吴乃虎，科学出版社，1998 3. 基因工程原理（第二版）下册，吴乃虎，科学出版社，2001 4. 现代基因操作技术，胡福泉主编，人民军医出版社，2000 5. 基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社，1999
6. 基因工程实验技术（第二版），彭秀玲编著，湖南科学技术出版社，1998
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6.2参考产品目录：
很多分子克隆技术是由一些知名公司开发出来的，其分子生物学产品目录产品介绍部分有很多值得我们学习的信息。她既对产品所涉及的基因操作原理作出论述，也对产品的技术参数作出详细的比较介绍。其工作原理、操作步骤深入浅出，图文并茂，帮助初学者对操作原理和实验步骤的理解。其附件、附表等参考信息栏目对研究工作者也有很强的借鉴意义。如 New England Biolabs 公司在分子生物学试剂方面， Bio-Rad公司在分子生物学仪器方面 都有很深的造诣。
1.Invitrogen公司分子生物学产品目录www.invitrogen.com 2.New England Biolabs 公司分子生物学产品目录 www.neb.com 3.Promage公司分子生物学产品目录 www.promage.com.cn 4.TAKARA公司分子生物学产品目录 www.takara.com.cn 6.3参考网站：
互联网上有很多关于分子生物学以及生物芯片的网站，这里仅仅罗列了一部分。 www.bioon.com 生物谷 www.biooo.com 中国生物论坛
www.biolover.com 中文分子生物学个人交流网 www.dnalc.org 冷泉港实验室
www.ncbi.nlm.nih.gov 美国国立生物信息中心 www.genehealth.com.cn上海百傲科技有限公司
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附录
.附录一 质粒DNA的提取
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 一、原理：
从细菌如大肠杆菌或枯草杆菌中提取DNA的方法很多，其分离原理可根据DNA分子大小的不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法、酸酚法；PEG法、煮沸法以及溴化乙锭——氯化铯梯度离心法。这些方法各有利弊，有的操作繁琐，难以控制，有的纯度不够，有的需要昂贵的仪器。而碱变性法被认为是一种既经济，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用这种方法提取的DNA可用于酶切、连接和转化。
碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环结构的两条互补链不能完全分离，当以pH4.8的NaAC缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存于溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构，通过离心与不稳定的大分子RNA、蛋白——SDS复合物等一起沉淀下来而去除，从而达到分离的目的。 二、操作步骤：
1．挑取大肠杆菌DH5α（pUC19）单菌落接种于20mLLB液体培养基中（含氨苄青霉素100ug/ mL），于37℃振荡摇床中培养过夜（10－12小时）。 2．试剂盒提取质粒步骤
（1）柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
（2）取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
注意：1）如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转4-6次使菌体充分裂解。
2）温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
（3）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。
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注意：P3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
（4）小心地将上清倒入或用移液器转移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。室温放置1-2分钟，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
*推荐步骤（可根据实验具体情况取舍）：向吸附柱中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（5）向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（6）向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液。 吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（7）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl预热的无菌去离子水，室温放置1分钟，12,000rpm离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH低于7.0会降低洗脱效率。
*为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤（7）。 注意：洗脱液体积不应小于50μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
pUC19质粒示意图
3．碱法提取质粒步骤（略）
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附录二 琼脂糖凝胶电泳
一、原理：
溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发出荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA含量，如将已知的标准样品做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需5~10ng（1ng=10-9μg）DNA，就可从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测0.05μg~0.01μg的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值呈反比关系。可以以此特征区别染色体DNA、质粒DNA和RNA，若用小刀取下含质粒DNA的凝胶带经电泳洗脱则可得纯DNA。若将质粒DNA用单一切点的酶消化后，与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小。DNA分子在凝胶中泳动的速度还与DNA分子本身的构型有关，共价闭合环状DNA（cccDNA）,一条链断开的开环DNA（ocDNA）,两条都断开的线状DNA（LDNA）在电泳中的迁移速率不同，一般cccDNA泳动最快，LDNA次之，ocDNA最慢，因而可以通过电泳来区别质粒DNA的构型。 二、操作步骤：
1、选择适当大小的电泳槽（大、中、小、微等类型）。
2、选择适当大小的点样梳其底部离电泳槽水平面的距离为1~2mm。
3、制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子量的大小，决定凝胶中琼脂糖的含量。一般可参照下表： 琼脂浓度（%） 分离线型DNA分子的有效范围（Kb） 0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3 4、称取1%浓度的琼脂糖，加入TBE（或TAE）缓冲液，在微波炉中熔解，待凝胶冷却
到50℃左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。
5、待凝胶冷却至凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，使其正好漫过凝胶表面，然后取出点样梳，保持点样孔的完好。
6、在待测样品中加入1/5体积的上样缓冲液，混匀后小心地进行点样。每孔加样10~15μl,一般不超过20μl。
7、打开电源开关，最高电压不超过5V/cm,即小电泳槽不得超过50V,当琼脂糖浓度低于0.5%时，电泳温度不能太高。
8、电泳时间随实验具体要求而定，一般待DNA带分开后即可停止，当溴酚蓝泳动至2/3凝胶时可停止电泳，约需1.5小时左右。
9、电泳结束后，小心取出凝胶，放入染色液中染色15’左右。
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