10、将凝胶放在紫外观察灯下观察电泳结果。
质粒构型观察示意图
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附录三 DNA的纯度、浓度的测定
——紫外分光光度法
一、原理：
核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。根据经验数据，纯核酸溶液OD260=1.8~2.0时，认为已达到所要求的纯度。在样品中含有蛋白质等杂质时，会使OD260/OD280的比值下降。用此法测定时，只能区别核酸和蛋白质，而无法区别质粒DNA与染色体DNA及RNA。 二、计算
DNA浓度（μg/mL）=OD260×稀释倍数×50×L
DNA纯度= OD260/ OD280（要求比值在1.8~2.0范围内） 注：L为比色杯厚度（cm,一般为1cm。）
核酸和蛋白质的吸光度
蛋白质/% 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 三、操作步骤：
1、取石英杯两只，分别加入TE缓冲液2990μl。(根据上次实验提取质粒的质量和浓度，适当调整稀释倍数。稀释倍数过大可能影响测量结果的准确性。)
2、在对照杯中加入10μl TE buffer,在样品杯加入10μl样品。盖上盖子，上下几次摇匀。
3、放入751型分光光度计的比色槽中，使用氢灯，分别测出OD260和OD280的值。 4、按上述计算公式算出你所制备的DNA的纯度和浓度。
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核酸/% 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 OD260：OD280 0.57 1.06 1.32 1.48 1.59 1.67 1.73 1.78 1.81 1.84 1.87 蛋白质/% 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 核酸/% 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 OD260：OD280 1.89 1.91 1.93 1.94 1.95 1.97 1.98 1.98 1.99 2.00 附录四 DNA的酶切和连接（体外重组）
一、原理：
各种限制性内切酶能专一的识别和切开特定的碱基顺序：
Hind III酶识别和切割顺序为：
↓
5’……A——A——G——C——T——T……3’ 3’……T——T——C——G——A——A……5’
↑
Hind III在载体pUC19上只有一个酶切点，用Hind III酶切载体pUC19时，就产生带有AGCTT的5’粘性末端的线型DNA分子。
用Hind III切λDNA（48.5kb），则产生23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125bp大小8个片段。
由于采用同样的限制性内切酶酶切质粒pUC19和λDNA，在T4DNA连接酶的作用下，pUC19（载体）和λDNA（供体）不同大小片段的DNA粘性末端共价结合，产生一个线型的重组DNA分子。在T4DNA连接酶的继续作用下，重组DNA分子两端的粘性末端又共价结合，自身环化成为一个重组的环形DNA分子。 二、操作步骤：
1、酶切反应：按顺序在灭菌的1.5mLEppendorf管中加入 （1） 无菌去离子水 （2） 10×酶切缓冲液 （3） λDNA或质粒pUC19
（4） 限制性内切酶EcoRI或Hind III（在冰浴中进行，防止酶失活）。
盖紧上述两只Eppendorf管盖子，用手指弹几次使混合均匀。在离心机上离心5s，使样品溶液集中到Eppendorf管底部。
于37℃水浴酶解2小时后，取上述两个样品的酶切反应物溶液各4μl，进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切反应情况。剩余的样品继续在37℃水浴中酶切2小时。
2、酶切反应的终止。待电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置65℃水浴中保温10-15分钟，然后在冰上冷却3分钟，以中止酶切反应。
2、连接反应：按顺序在灭菌的1.5mLEppendorf管中加入 （1） 无菌去离子水
（2） 10×T4DNA连接酶缓冲液 （3） 供体：λDNA酶切（纯化）产物 （4） 载体：质粒pUC19酶切（纯化）大片段
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（5） T4DNA连接酶（在冰浴中进行，防止酶失活）
注意：为取得较好的转化效率，供体和载体的摩尔比应控制在3－10：1。 将连接反应管中摇匀后放入12℃条件下连接反应过夜或16℃下连接反应2-3小时。 操作中的注意事项：
1、基因工程是微量操作技术，DNA样品与内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的标准性。
2、要注意酶切时加样的次序，各项试剂加好后，最后再加酶液。待用的内切酶要放在冰中，用后立即放回-20℃冰箱，防止内切酶失活。
3、凡用在酶切和连接反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，吸头等），都要反复用水洗干净，最后用ddH2O清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。
4、当样品在37℃与65℃保温时，请注意防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使溶液体积大量增加而造成实验失败。同时要防止由于标签脱落而分不清样品类型。
附录五 大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化
一、原理：
重组DNA转化不同细菌有不同的转化效率。转化效率的高低与受体菌的感受态有关。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多，目前主要两种假设：1、局部原生质体化假说，即认为是由于细菌表面的细胞壁结构发生变化——局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过细胞膜进入细胞；2、酶受体假说，认为感受态细胞的表面形成一种感受态的细胞使极少数。而只有感受态的细胞才能稳定地收取外源DNA分子。而且感受态是在短暂时间内发生地。一般出现在细菌对数生长的后期。作为基因工程的受体菌必须是基因重组缺陷突变体，必须能同外来DNA分子发生遗传重组，同时它们又必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。使外来基因（DNA）不受其限制酶的降解，这样才能进行遗传操作。受体菌的感受态往往通过CaCl2处理而获得。DNA分子转化的复杂过程如下：
1、吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；
2、转入：双链DNA分子解链。单链DNA分子进入受体菌，另一条链被降解； 3、自稳：外源质粒DNA分子在受体菌内又复制成双链环状DNA；
4、表达：外源基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。对DNA分子来说，成功转化的比率极小，仅占DNA分子的0.01%。 二、操作步骤：
（一）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
1、从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mL LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mL LB液体
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培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
2、每组取培养液2个1.5mL转入1.5mL离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； 3、倒净上清培养液，用1mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； 4、0～4℃，4000r／min离心10min；
5、弃去上清液，加入500μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；
6、弃去上清液，加入100μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5mL离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。 （二）细胞转化
1、分别取3个100μl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入10 μl重组质粒DNA(体积不超过10μl)+ 100μl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng+100μl感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng 未酶切质粒DNA十100μl感受态细胞悬液。
2、将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min
3、立即向上述管中分别加入0.8mL LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.9mL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。 （三）平板培养（有时需要稀释）
1、取各样品培养液0.1mL，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。
2、 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，此时应该能清楚地看到白色菌落。
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5×10 －2×10个转化菌落。在实际工作中，每微克有10以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。 （四）检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数，按下列公式计算转化率。
转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）
转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）
5
6
7
20