蛋白质的双向电泳
一、 实验原理：
2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、 实验步骤：
1. 芽孢杆菌蛋白质的提取
2. 蛋白质样品的纯化
将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。 水化液配置：用dd H20定容
水化液 尿素（60.06）
硫脲（76.12） CHAPS DTT(154.2)
浓度 7M/L 2M/L 4% 1%
100ml 42.0g 15.2g 4g 1g
20ml 8.4g 3.04g 0.8g 0.2g
（注：DTT现用现加）
3. Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。 取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。 例如：
标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数
据可知
G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
表-1 五种蛋白质测定方法的比较
方法 凯氏定氮法（Kjedahl法） 双缩脲法 （Biuret法） Folin-酚试剂法 （Lowry法） 考马斯亮蓝法 (Bradford法) 紫外吸收法 50～100μg 1～5μg 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收
各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸 强碱性缓冲液，TritonX-100,SDS 5μg 磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和 Phe还原 硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇 1～20mg 灵敏度 0.2～1.0mg 原理 将蛋白质转换为氮，用酸吸收后滴定 多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物 干扰物质 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸 3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水,16-18个小时）
3. 蛋白质的水化
蛋白质的上样浓度，选用胶条长度17 cm， PH 3-10：蛋白质上样量为600ug/300ml,最终体积为300ml，蛋白质含量为600ug 。
若测得蛋白质量：B为12ug/ul (600/12=50)，按每管50ul分装，加250ul水化液体，最终体积300ul（体积300ul，蛋白质含量600ug）。
IPG胶条蛋白质载样量（考马氏亮蓝R-250）
胶条长度 7 cm 11 cm 17 cm
4. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 3-10），室温中放置30分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
5. 加样： 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。分两次吸取样品，每次300ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽一侧(17cm，pH 3—8 ， 蛋白质上样量600ug/300ul)胶条。
加样体积 125 ul 185 ul 300 ul 样品蛋白量 169 ug 250 ug 405 ug
6．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡，使水化液浸湿整个胶条，10分钟。
7. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验2ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上，盖上盖子放置在室温，14小时。（用水平仪调整胶曹的水平）
8．上胶：取出过夜的胶条，正面向上放置在用超纯水润湿的滤纸上吸除矿物油。取滤纸桥用超纯水润湿，放置在IEF的正负两级上。从正极到负极将胶条压入槽中，同时加入矿物油，注意把气泡赶出，盖上盖子。
17 cm聚焦盘
9. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦（16-18小时）
温度
最大电流
胶条水化体积 电压
S1 ( 50v , slow，慢速 溶胀) S2 ( 250v, line, 线性 除盐) S3 ( 1000v, rapid, 快速 除盐) S4 ( 9000v, line, 线性 升压) S5 ( 9000v, rapid, 快速 聚焦) S6（ 500v, rapid 快速 保持）
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50?A/根） 设置等电聚焦时的温度。（20℃）
IPG运行条件(17cm胶条)
20℃
50uA per IPG strip 300 (17cm IPG strip) 时间 10min 30min 50mine 4.50h 65000vh 任意时间
高通量聚焦槽
10.IEF主机通电检查，如屏幕显示如下，则为正常
BIO-RAD LABORATORIES PROTEAN IEF CELL FIRMWARE VERSION 1.40 SYSTEM INITIALIZATION
之后，屏幕会显示如下 REHYDRATION > PRESET METHOD > STORED METHOD > NEW METHOD >
IPG胶条所需水化液体积
胶条长度(cm)
每条需水化液体体积(ul)
不同胶条长度胶条等电聚焦程序设置：
7cm胶条
水化 12小时（18℃） 主动水化（50V）或被动水化
S1 S2 S3 S4 S5
250V 500V 4000V 4000V 500V
线性 快速 线性 快速 快速
30分钟 30分钟 3小时
除盐 除盐 升压 聚焦 保持
7 125
11 200
13 250
18 350
24 450
20,000伏小时 任意时间
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50?A/根） 设置等电聚焦时的温度。（20℃） 11cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化