20.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
21. 凝胶固定：固定液配置1升，每块胶用量500ml。
乙醇 乙酸 ddH20
400ml
100ml
500ml
量取配制好的固定液500ml，倒入凝胶固定槽，将胶块在水的张力的作用下置入固定液中，然后用保鲜膜密封凝胶固定槽，放置在摇床上3h。（将蛋白质固定） 22.染色：
染色液的配置：体积1L 磷酸
硫酸铵
G-250
ddH20
定容至
甲醇（最后加）
100ml 100g 1.2g 200ml 800ml 200ml
染色，用真空泵抽出凝胶固定槽中的凝胶固定液，用超纯水清洗两次，一块凝胶加入500ml的染色液，用保鲜膜密封凝胶固定槽，放置在摇床上过夜，12-20个小时。 23.脱色：脱色液Ⅰ，ddH20 1200ml，加入硫酸铵75g溶解后定容1350ml，脱色前加入150ml甲醇，至总体积1.5L。量取1L脱色液，进行脱色20min.。剩余的500ml脱色液加入500ml超纯水作为脱色液Ⅱ，每块胶500ml，过夜脱色。 表22 进行第二向垂直凝胶电泳的推荐电泳条件
步骤 Hoefer miniVE或SE260
1.5mm厚度凝胶 1.0mm厚度凝胶 Hoefer SE600 1.5mm厚度凝胶 1.0mm厚度凝胶
表24 利用ExcelGel进行电泳的电泳条件
步骤 电压
（v）
Excel Gel SDS，梯度，8-18% Excel Gel XL SDS，梯度，
12-14%
①
电流（MA/块凝胶） 15
30 10 20 15 ② 3010 20②
持续时间 0：15 1：30① 0：15 1：30① 0：15 1：300：15
①
1 2 1 2 1 2 1 2
1：30①
电流强度 （mA） 20 50 20 40
功率 （w） 30 30 40 40
持续时间 （h：min） 0：25—0：301：10② 0：45
②
2：40
① ①
1 2 1 2
600 600 1000 1000
当溴酚兰染料前沿从IPG胶条移出4—6mm（Excel Gel XL SDS 12—14%）或1—2mm（Excel Gel SDS 8—18%）时，撤掉IPG胶条及加样片。然后将阴极缓冲条移至IPG胶条原来覆盖的区域。调整阴极电极的位置。
② 当溴酚兰前沿刚到达阳极缓冲条后5分钟，停止电泳，撤掉缓冲条。
A．
药品
CHAPS 兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用， SDS 离子型去垢剂 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出 尿素 离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质 硫脲 离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可 以大大增加蛋白质的溶解性
DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀
BSA Bradford中制作标准曲线用
无水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的环境 磷酸 提供Bradford中的酸性环境
Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化 IPG buffer
覆盖液 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。
丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂， 甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构
溴酚兰 指示剂作用
碘乙酰氨（IAA） 平衡液B中使用，中和A液中的DTT 甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好
考马斯亮兰G250（Bradford法用） 考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量
甘氨酸 与Tris构成缓冲系统