S1 S2 S3 S4 S5
250V 1000V 8000V 8000V 500V
线性 快速 线性 快速 快速
30分钟 除盐 除盐 升压 聚焦 保持
30分钟 4小时 40,000伏小时 任意时间
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50?A/根）
设置等电聚焦时的温度。（17℃）
17cm胶条
水化 12小时（20℃） S1 S2 S3 S4
250V 1000V
主动水化（50V）或被动水化
30分钟 1小时
除盐 除盐 升压 聚焦 保持
线性 快速 线性 快速
10000V 10000V 5小时 60,000伏小时 任意时间
S5 500V 快速 选择所放置的胶条数。
设置等电聚焦时的温度。（20℃）
4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE 4.1 配制12.5%的丙烯酰胺凝胶两块
设置每根胶条的极限电流。（50?A/根）
配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS 3ml 称取0.3g 10% APS 3ml 称取0.3g) (1). dd H20 62.7ml
(2).30% Acr/Bis 83.3ml （购买）
(3).1.5mol/L Tris—HCl PH =8.8 50ml （购买） (4).10%SDS 2 ml 配置 (5).10%APS 2 ml 配置
(6).TEMED（购买） 35- 40 ul 【(5)和(6)使胶凝固】
（注：10%APS 和TEMED最后在灌胶前加，加入后在搅拌时尽量减少气泡） 4.2 灌胶（注意短板的摆放）
将玻璃板洗净后，室温晾干。然后,将电泳槽平衡好，在两块胶之间放夹层，最后的盖板用钳子拧紧，以免漏胶。将将配好的胶倒入注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间超纯水封面，保持胶面平整胶曹（3 ml 左右dd H20压胶，注意不要有气泡产生）。将做好的胶用保鲜膜盖住，胶放置4小时。
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
溶液成分
6% 水
30%丙烯酰胺溶液 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸氨 TEMED 8% 水
30%丙烯酰胺溶液 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸氨 TEMED 10% 水
30%丙烯酰胺溶液 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸氨 TEMED 12% 水
30%丙烯酰胺溶液 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸氨 TEMED 15% 水
30%丙烯酰胺溶液 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸氨 TEMED
5 2.6 1 1.3 0.05 0.05 0.004 2.3 1.3 1.3 0.05 0.05 0.003 1.9 1.7 1.3 0.05 0.05 0.002 1.6 2 1.3 0.05 0.05 0.002 1.1 2.5 1.3 0.05 0.05 0.002
10 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 4 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 3.3 4 2.5 0.1 0.1 0.004 2.3 5 2.5 0.1 0.1 0.004
15 7.9 3 3.8 0.15 0.15 0.012 6.9 4 3.8 0.15 0.15 0.009 5.9 5 3.8 0.15 0.15 0.006 4.9 6 3.8 0.15 0.15 0.006 3.4 7.5 3.8 0.15 0.15 0.006
20 10.6 4 5 0.2 0.2 0.016 9.3 5.3 5 0.2 0.2 0.012 7.9 6.7 5 0.2 0.2 0.008 6.6 8 5 0.2 0.2 0.008 4.6 10 5 0.2 0.2 0.008
25 13.2 5 6.3 0.25 0.25 0.02 11.5 6.7 6.3 0.25 0.25 0.015 9.9 8.3 6.3 0.25 0.25 0.01 8.2 10 6.3 0.25 0.25 0.01 5.7 12.5 6.3 0.25 0.25 0.01
30 15.9 6 7.5 0.3 0.3 0.024 13.9 8 7.5 0.3 0.3 0.018 11.9 10 7.5 0.3 0.3 0.012 9.9 12 7.5 0.3 0.3 0.012 6.9 15 7.5 0.3 0.3 0.012
40 21.2 8 10 0.4 0.4 0.032 18.5 10.7 10 0.4 0.4 0.024 15.9 13.3 10 0.4 0.4 0.016 13.2 16 10 0.4 0.4 0.016 9.2 20 10 0.4 0.4 0.016
50 26.5 10 12.5 0.5 0.5 0.04 23.2 13.3 12.5 0.5 0.5 0.03 19.8 16.7 12.5 0.5 0.5 0.02 16.5 20 12.5 0.5 0.5 0.02 11.5 25 12.5 0.5 0.5 0.02
1.1配制12.5%的丙烯酰胺凝胶：
配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS 3ml 称取0.3g 10% APS 3ml 称取0.3g) (1). dd H20 62.7ml
(2).30% Acr/Bis 83.3ml （购买）
(3).1.5mol/L Tris—HCl PH =8.8 50ml （购买） (4).10%SDS 2 ml 配置 (5).10%APS 2 ml 配置
(6).TEMED（购买） 35- 40 ul { (5)和(6)使胶凝固 ｝
（注：10%APS 和TEMED最后在灌胶前加，加入后在搅拌时尽量减少气泡）
1.2电泳液配置：（4L）
甘氨酸
SDS
Tris
57.6g 4g 12.12g
dd H20
定容4L
2. 灌胶：将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，盖板用钳子拧紧，以免漏胶。将配好的胶倒入注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间超纯水封面，保持胶面平整胶曹（3 ml 左右dd H20压胶，注意不要有气泡产生），做好的胶用保鲜膜盖住，胶放置4小时。 3.平衡液配制（减少电内渗，使被分离的蛋白质与SDS完整结合）
平衡液
尿素 1.5mol/L Tris-HCl
甘油
SDS 溴酚蓝 ddH20
浓度 6M 1.5M 30% 2% 0.002% 加至 10ml
100ml 36.04g 3.34ml 30ml 2g 200ul 100ml 管分装
50ml 18.02g 1.67ml 15ml 1g 100ul 50ml -20°C
4. 配制胶条平衡缓冲液I 。｛10ml平衡液储液中加DTT 0.1g。（2根胶条）｝
加DTT使变性的非烷基化蛋白处于还原状态
5 ．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚
滤纸用 超纯水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入 5ml 胶条平衡缓
冲液I 。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。
胶条的长度 胶条平衡缓冲液I 胶条平衡缓冲液II 7cm 2.5ml 2.5ml 11cm 4ml 4ml 17cm 6ml 6ml 18cm 6ml 6ml 24cm 8ml 8ml 7. 配制胶条平衡缓冲液II 。｛10ml平衡液储液中加入碘乙酰胺0.5g。（2根胶条）｝
加碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化
8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I 。并用滤纸
吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。
9.用滤纸吸去 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二
向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将 10×电泳缓冲液，用量筒稀释 10 倍，成 1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II 。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
13.将 IPG 胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的 SDS-PAGE 凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（2ml超低熔点琼脂胶）。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶
面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
向电泳缓冲液中加0.5%的琼脂糖
超低熔点琼脂糖50ml 琼脂糖 18.02g 超纯水 10ml 溴酚兰 25ul
17．清洗水浴锅，加入适量水，水预锅温度设置16度。
18.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
图中选用XL凝胶夹和XL封边垫条
19.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm ）或低电压，待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm ），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
IPG胶条的长度 7 cm 17cm 起始电流 5mA/gel 5mA/gel 加大后电流 15-20mA/gel 20-30mA/gel