转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文

Ｙ１５３０９６４硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究ＳｔｕｄｙｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａａｎｄｌｙｃｏｐｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ学科专业：生物化学与分子生物学研究生；牛昆指导教师：季静教授天津大学化工学院二零零八年六月摘要番茄红素是存在于番茄、西瓜、红色萄萄柚等果实中的一种天然类胡萝卜素。１９９５年开始国外对番茄红素的功能性研究引起重视，并确认番茄红素具有较强的防癌和抗癌功能，尤其具有预防前列腺癌的功能。效果优于Ｂ一胡萝卜素。酿酒酵母遗传背景清楚，胞内含有番茄红素合成前体比较丰富，而且可以方便的应用于食品工业，在转基因方法产番茄红素的领域中，酿酒酵母因其诸多优点，而得到越来越多的重视和应用。目前应用于转基因酵母的类胡萝卜素合成酶基因均来源于细菌和真菌，本文首次将来自于药用草原黄花龙胆的类胡萝卜合成酶基因：八氢番茄红素合成酶基因（ｐｓｙ）√＼氢番茄红素脱氢酶基因ｐｄｓ、ｚｄｓ）。质粒ＹＣｐ２２－Ｇａｌ－ｐｓｙＹＥｐｌａｃ１９５－ｐｄｓ、ＹＥｐｌａｃｌ８１－ｚｄｓ（质粒为本实验室构建）经验证后逐一转入酿酒酵母ｗ３０３菌株中，并得到了阳性转化子。对挑取的阳性转化子进行连续三次的发酵实验，得到了遗传性状比较稳定的一株转化菌株，使用酸热法提取色素物质，进行ＨＰＬＣ检测，与番茄红素标准品进行比对，证实了类胡萝卜素合成酶基因在转化菌株中得到表达，产生了番茄红素，并利用ＨＰＬＣ对样品定量，得到了转化菌株的原始番茄红素产生量６０肛ｇ／ｇ。本实验继续对此酿酒酵母阳性转化子的发酵培养基进行了探索，分别通过对速效碳源、迟效碳源、有机氮源、无机氮源、金属离子、中间代谢物的有效性和浓度的探索，最终确定了葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、苹果酸钠、柠檬酸钠、ＦｅＳ０４、ＭｇＳ０４这８种因素对番茄红素的产生是有着积极影响的，对这８种因素分别取三水平进行Ｌ２７３８的正交实验，最终得到了２．４％葡萄糖，１．２％蔗糖，１．０７％蛋白胨，０．３５％酵母粉，０．０４％苹果酸钠，０．０６％柠檬酸钠，０．０１％ＦｅＳ０４以及０．０１５％ＭｇＳ０４作为最优的发酵培养基并使得番茄红素的产量提高了６０％，初步达到了筛选培养基的目的。关键词：番茄红素转化ＨＰＬＣ酿酒酵母培养基优化ＡｂｓｔｒａｃｔＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓａｒｅｙｅｌｌｏｗ，ｏｒａｎｇｅ，ａｎｄｒｅｄｐｉｇｍｅｎｔｓｗｈｉｃｈｏｎｅａｒｅｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅ．Ｌｙｃｏｐｅｎｅｉｓｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓａｎｄｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｃｌｕｄｅｓｔｒｏｎｇｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ，ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｃａｎｃｅｌ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｈａｓｃｌｅａｒｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，Ｔｈｅｃｅｌｌｃｏｎｔａｉｎｓｌｙｅｏｐｅｎｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓａｎｄｃａｎｂｅｅａｓｉｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｔｈｅｌｙｃｏｐｅｎｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｈａｓｍａｎｙａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｇｅｔｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｌｌＡｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｓｙｎｚｙｍｅｓｔｈａｔｕｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｉｃｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｄｆｕｎｇｕｓ．ＡｎｄｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｓｙｎｚｙｍｅｓｉｎＧｅｎｔｉａｎａｌｕｔｅａ．Ｔｈｅｙａｒｅｏｕｒａｒｅｓｔｕｄｙａｒｅｆｒｏｍｐｈｙｔｏｅｎｅｃａｒｏｔｅｎｐｉｄｓｓｙｎｚｙｍｅｓｐｓｙ，ｐｈｙｔｏｅｎｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｐｄｓａｎｄｚｄｓ．ＯｕｒＬａｂｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｒｅｅ．ｐｌａｓｍｉｄｓＹＣｐ２２一Ｇａｌ—ｐｓｙＹＥｐｌａｃｌ９５－ｐｄｓ．ＹＥｐｌａｃｌ８１－ｚｄｓ，ａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎ＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｗ３０３．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｔａｔ６０肛ｇ／ｇ（ｄｒｙｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｌｙｃｏｐｅｎｅｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｉｇｈｔ）ｏｆｃｅｌｌｓ．ＴｈｉｓｗａｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｐａｒｔｉａｌｌｙｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄｔＯａｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｃａｒｂｏｎｆｌｏｗｉｎｔｏｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｅｉｎｇｔｈｅｎｏｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐａｔｈｗａｙｆｏｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ．Ｂｙｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｒａｐｉｄｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｓｌｏｗｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｍｅｔａｌｉｏｎ，ｖａｌｉｄｉｔｙａｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｏｄｉｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，８ｆａｃｔｏｒｓ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ，ｐｅｐｔｏｎｅ，ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ，ｂｒｉｎｇｓｐｏｓｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｔｏｔｈｅｍａｌａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ，ＦｅＳ０４ａｎｄＭｇＳ０４ｏｆｔｈｅ８ｆａｃｔｏｒｓｗｉｔｈ３ｌｅｖｅｌｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｙｃｏｐｅｎｅ．Ｌ２７＿３——８ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｓｌａｕｎｃｈｅｄ．ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｍｅｄｉｕｍｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｓ２．４％ｇｌｕｃｏｓｅ，１．２％ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ，１．０７％ｐｅｐｔｏｎｅ，０．３５％ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ０．０４％ｓｏｄｉｕｍ’ｍａｌａｔｅ，０．０６％ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ，０．０１％ＦｅＳ０４ａｎｄ０．０１５％ＭｇＳ０４．Ｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｙｃｏｐｅｎｅｂｙ６０％．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｓａｃｈｉｅｖｅｄｐｒｉｍａｒｉｌｙ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ，Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｙｃｏｐｅｎｅ，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＨＰＬＣ，ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＭｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚｅ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：≯∞孑年５月≥ｏＥｌ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解苤盗盘鲎有关保留：使用学位论文的规定。特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：—ｔ．以厶Ｊ｛、ａ翩毪硝签字同期：少衫年ｌ－月弘同签字同期：ｗ。降Ｓ月弓Ｄ同天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究第一章文献综述１．１类胡萝Ｉ、素类物质简介１．１．１类胡萝ｌ、素类物质的结构特点类胡萝卜素类物质通常是指Ｃ４０的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物（叶黄素）两大类色素的总称ｎ１。它们在结构上由８个类异戊二烯单位浓缩形成，典型的Ｃ４０类胡萝卜素携带紫罗酮环（Ｉｏｎｏｎｅ），在环上不同位置的氢原子可被氧基、羟基、环氧基代替；类胡萝ｂ素分子中最重要的部分是决定颜色和生物功能的共轭双键系统。类胡萝卜素类物质是所有光合生物的基本成分，贮存在生物体的脂相中。在植物中，类胡萝卜素类物质担当叶绿体光合作用的辅助色素和保护叶绿素免受强光破坏，同时也是合成植物激素ＡＢＡ的前体。除八氢番茄红素、六氢番茄红素等几种类胡萝ｂ素无色外，绝大多数类胡萝卜素类物质呈黄色、橙色．或红色嘲。１．１．２类胡萝ｌ、素类物质的主要生理功能１．１．２．１类胡萝Ｉ、素的ＶＡ原活性人和动物除了从奶、蛋、肝脏、鱼肝油及其衍生物等食物中获取ＶＡｌ３］外，植物中的类胡萝卜素也是ｖＡ的重要来源。许多类胡萝ｂ素类物质只要其分子一端具有１５酮芷环且其侧链长不少于ｌ１个碳，均具有ＶＡ活性，其中以１３．胡萝卜素活性最高ｆ钔。类胡萝卜素类物质具有顺反构型，其中顺式构型的类胡萝ｂ素ＶＡ活性最高。１３．胡萝ｂ素缺乏会造成维生素Ａ缺乏症，引起角膜上皮的脱落、增厚和角质化，使原来透明的膜变得不透明，造成角膜溃疡。轻者会导致夜盲症，重者会损害上皮组织细胞的生长与分化，使人的皮肤变厚、干燥、痂变或发生皱纹。因此，维生素Ａ可以治疗各种皮肤角化症。１．１．２．２类胡萝Ｉ、素类物质的抗氧化作用【５】类胡萝ｂ素类物质分子结构中含有多个共轭双键，具有捕获、淬灭单线态氧和自由基的能力，是有效的抗氧化剂，可减少自由基对细胞遗传物质和细胞膜的