转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文(6)

第二章将目的基因转入酿酒酵母固体：在液体培养基中加入１．５％（ｗ／ｖ）琼脂粉。高效产孢培养基：１％ｉＡｃ０．１％酵母提取物５００．０５％葡萄糖１００ｍｇ／Ｌ腺嘌呤ｍｇ／Ｌ色氨酸ｍｇ／Ｌ亮氨酸ｍｇ／Ｌ组氨酸ｍｇ／Ｌ尿嘧啶１００５０１００注：根据需要可省却特定的氨基酸成分。预产孢培养基：１％ＫＡｃ１％酵母提取物２％蛋白胨５一氟乳清酸（５－ＦＯｂ）培养基：３％琼脂溶液：１００Ｍ高压灭菌。配制１００ｍｌ下列溶液，ＹＮＢＷ／ｏ从１．４９Ｄｒｏｐｏｕｔｐｏｗｄｅｒ０．１７９组氨酸３０ｒａｇ腺嘌呤１０ｍｇ色氨酸２０ｒａｇ葡萄糖４９尿嘧啶２０ｍｇ亮氨酸４０ｍｇ５－ＦＯＡ０．２９在４５℃搅拌（ＦｏＡ需要一定的时间溶解），过滤除菌后。将上述两种溶液混合均匀后倒平板。天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究２．２实验方法２．２．１大肠杆菌感受态细胞的制备与转化２．２．１．１ＣａＣｌ２法１．将ＤＨ５Ｑ接入５ｍｌＬＢ液体培养基中，３７＂Ｃ过夜摇培，２５０ｒｐｍ２．按１％的接种率将液培管中的菌液接种到ＬＢ摇瓶中，３００ｒｐｍ）３７＂Ｃ摇培３ｈ（≥３．摇瓶在冰水中迅速冷却至Ｏ＇Ｃ，分装至冰预冷的离心管（５０ｍ１），冰置数分钟４．４℃，４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ回收细胞，将残留液空干（迅速）５．冰预冷的１０ｒａｌ０．１Ｍ的Ｃａｃｌ。重悬细胞，４＂Ｃ，４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ回收细胞６．１０ｍｌ０．１Ｍ的Ｃａｃｌ。重悬细胞，冰浴１ｈ以上７．４＂Ｃ，４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ回收细胞８．每５０ｍｌ原培养物用２ｍｌ含１５％甘油的Ｃａｃｌ２来重悬，分装于１．５ｍｌ离心管，２００ｕｌ每管。－－８０℃保藏。９．将１－１０Ｌ质粒ＤＮＡ和ｌｍｌ感受态细胞混匀，置于冰上３０ｒａｉｎ。１０．４２＂Ｃ水浴保温９０ｓ，热休克，置于冰上冷却２ｍｉｎ。１１．加入２倍体积的液体ＬＢ，３７＂Ｃ振荡培养４５ｍｉｎ，离心浓缩菌体，弃上清。１２．用液体ＬＢ悬浮菌体，然后涂布在含有抗生素的ＬＢ平板上，３７。Ｃ恒温培养。２…２１２电转化法１．将２．５ｍｌ新鲜的Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐｌＯ’过夜培养液接种到５００ｒａｌＬＢ培养基中。３７℃，振荡培养至ＯＤ６００为０．５到０．６。．２．冰上冷却１５ｍｉｎ，转移到预冷的离心管中，２～４℃５０００９离心２０ｍｉｎ，收集细胞。用与原培养物体积相等的冰水（２～４℃）清洗两次。３．用５ｍｌ冰水悬浮菌体。整个过程保持细胞的冰冷状态。２～４４Ｃ５０００９离心第二章将目的基因转入酿酒酵母２０ｒａｉｎ。弃上清，用剩余液体悬浮菌体。４．如果即刻使用，将菌悬液倒入另一个预冷的试管中，２～４℃５０００９离心１０ｒａｉｎ。用冰水悬浮细胞，使其终浓度约为２×１０１１个细胞／ｍ１。再将细胞分装在预冷的离心管中。５．如果冷藏备用，加入４０ｒａｌ冰的１０％的甘油，混匀，２，－－，４０ｃ５０００９离心１０ｒａｉｎ。用冰的１０％的甘油悬浮细胞，使其终浓度约为２ｘ１０１１个细胞／ｍｌ。再将细胞分装在预冷的离心管中。于干冰上快速冷冻，－８０＂Ｃ保藏。６．在含４０止感受态细胞的试管中加入１此ＤＮＡ（１０ｐｇＤＮＡ），用微量移液器轻轻搅拌数次，混匀。７．将混合物转移到预冷的电转槽中。擦去电转槽表面水气，插入电转化仪中。８．电转化：设定电压为１７００Ｖ，放电一次。９．立即在电转槽加入ｌｍｌＬＢ液体培养基，转移到一个无菌试管中。３７℃缓慢振荡培养３０－＇－，６０ｍｉｎ。ｌＯ．回收细胞，涂布于含抗生素的ＬＢ平板上，３７＂Ｃ恒温培养。２．２．２小规模提取大肠杆菌质粒法（ＣＴ柚法）１．挑取转化子接入５ｍｌＬＢ培养液的试管中，３７＂Ｃ摇培（２５０ｒｐｍ）过夜。２．在１．５ｍｌ的离心管中离心收获菌体（３Ｘ１．５ｍ１）。３．２００Ｉ－ｔｌＳＴＥＴ重悬菌体。４．加入５９ｌ溶菌酶（２５ｍｇ／ｍ１），混匀后在室温温浴５－－－，７ｍｉｎ。５．上述离心管在煮沸锅中煮沸ｌｍｉｎ。６．１３０００离心１５ｍｉｎ。７．牙签挑去粘稠物（破碎菌体）。８．加入１０Ｉ．ｔｌＣＴＡＢ溶液，混匀，室温２ｍｉｎ。９．１３０００离心５ｍｉｎ，弃上清。天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究１０．３００ＩｄＮａＣｌ溶解沉淀。１１．加入７５０山用冰预冷的无水乙醇，混合后冰上放置２０ｒａｉｎ。１２．１３０００离心１５ｍｉｎ，弃掉上清。１３．７０％乙醇ｌｍｌ洗涤沉淀。１４．１３０００离心５ｍｉｎ，弃去上清。１５．敞开离心管盖子，室温将沉淀凉干。１６．ＴＥ．２０Ｉ－ｔｌ溶解ＤＮＡ沉淀，一２０℃保存。１７．取适量质粒ＤＮＡ进行限制酶消化，琼脂糖凝胶电泳分析。２．２．３ＤＮＡ的限制酶消化１．单酶切体系在１．５ｍｌ离心管中，按以下成分建立酶切体系。１０×酶切缓冲液ｄｄＨ２０．１２ｔｔｌ７－ｘ。山ｘＤＮＡｍ限制性内切酶总体积０．２—０．４“ｌ２０ｍ将体系混匀，在提供酶试剂的厂商推荐温度下温育１～２小时。消化后的产物采用于琼脂糖凝胶电泳分析。２．双酶切体系在１．５ｍｌ离心管中，按以下成分建立酶切体系。２５第二章将目的基因转入酿酒酵母１０×酶切缓冲液２山ｄｄＨ：０１７－ｘｐｌＤＮＡＸＩｌｌ限制性内切酶１０．２－０．４ｍ限制性内切酶２０．２—０．４脚总体积２０山将体系混匀，在提供酶试剂的厂商推荐温度下温育１～２小时。消化后的产物采用于琼脂糖凝胶电泳分析。双酶切使用的公共缓冲液可在厂商网站上检索。２．２．４从琼脂糖中回收ＤＮＡ片段１．切取含ＤＮＡ片段的琼脂糖（１００－－－３００ｒａｇ），按切取重量：溶液Ａ体积为１：３的比例加入溶液Ａ。２．６５＂Ｃ水浴５～１０ｍｉｎ，至胶完全溶化。其间振荡２～３次助溶，溶化后冷却至室温时，加入１５ｍｌ溶液Ｂ，充分混匀。３．将溶液置于离心柱中，静置２ｍｉｎ，８２００ｒｐｍ离心２０＂～３０ｓ。若一次离不完，可分两次离心。４．弃去液体，在离心柱中加入５００ｍｌ溶液Ｃ，８０００ｒｐｍ离心２０－－－３０ｓ，弃去液体。５．重复步骤４。６．１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，甩干剩余液体以除去残余酒精。７．将离心柱置于新离心管中，敞开离心管盖室温放置５～１０ｍｉｎ，使乙醇挥发净。８．加入２５ｍｌ溶液Ｄ（５０℃水浴），静置２ｍｉｎ。９．１３２００ｒｐｍ离心‘３ｍｉｎ，管底溶液即为所需ＤＮＡ。１０．如果直接从溶液中回收ＤＮＡ，则在ＤＮＡ溶液中直接加入３倍体积的溶液Ａ