转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文(5)

天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究２．１．３主要药品表２．４主要实验药品Ｔａｂ．２?４Ｉｍｐｏｒｔａｎｔｍａｔｅｒｉａｌｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ药品名称酵母抽提物（Ｂａｃｔｏ—Ｙｅａｓｔ蛋白胨（Ｂａｃｔｏ—ｐｅｐｔｏｎｅ）胰化蛋白胨（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）ＹＮＢ（酵母氮源）各种Ｌ型氨基酸葡萄糖琼脂琼脂糖甘油Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅｘｔｒａｃｔ）生产商ＢＢｌＢＢＩＢＢＩＤｉｆｃＯＳｉｇｍａＡＭＥＲＳＣＯＢＢＩＡＭＥＲＳＣＯＢＢＩＡＭＥＲＳＣＯＢＢＩ溶菌酶Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ一２０ＴＰＥＧ４０００ＳｉｇｍａＡＭＥＲＳＣＯ１７第二章将目的基因转入酿酒酵母ＬｉＡｃＥＤｌＡ１ＨｓＮａＯＨＨＣｌＳｉｇｍａＢＢＩＩＣＮＳｉｇｍａＭＥＲＣＫＴｒｉｓ饱和酚（ｐＨ７．８）无水乙醇氯仿甲醇Ｄ．ｓｏｒｂｉｔｏｌａ－ｆａｃｔｏｒ上海生工ＭｌＥＲＣＫＭ哐ＲＣＫＭＥＲＣＫＢＢＩＳｉｇｍａＳｉｇｍａＢＢＩＢＢＩ过硫酸铵ＮａＣｌＧｌｙｃｉｎｅＵｒｅａＳＤＳＳｉｇｍａＣａｌＢｉｏＣｈｅｍＦｅｒｍｅｎｔａｓ内切酶、聚合酶２．１．４主要试剂阳Ｔｒｉｓ?ＨＣＩ溶液（５０ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）０．００５ｍｏｌＴｒｉｓ，２９．２ｍｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ加去离子水至１００ｍ１．ｐＨ８．０。ＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｏｌ／Ｌ）１８．６１９ＥＤＴＡ—Ｎａ?２Ｈ２０溶于ｌＯＯｍｌ水中，磁力搅拌剧烈搅匀，以固体Ｎａ０Ｈ调节ｐＨ值至８．０。髓溶液（１０ｍｇ／ｍ１）’１９溴化乙锭溶于１００ｍｌ去离子水中，磁力搅拌数小时，置于棕色瓶中室温保存。Ｎａ０Ｈ溶液（２ｍｏｌ／１）１８天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究称取８．０９ＮａＯＨ固体加水溶解，定容至ｌＯＯｍｌ。ＮａＡｃ溶液（３ｍｏｌ／Ｌ）取４０．８１９三水乙酸钠，加水溶解，以冰醋酸调节ｐＨ至５．２，定容至１００ｍｌ。ＬｉＡｃ（１．０Ｍ）称取１０．２０１９ＬｉＡｃ溶于适量水中，完全融解后定容止１００ｍｌ，过滤除菌。ＴＡＥ缓冲液（无需灭菌）５０×：２４２９Ｔｒｉｓ碱，５７．ｉｍｌ冰醋酸，１００ｍ１０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８：０），定容至１０００ｍｌ。１Ｘ：用时将上述储存液稀释５０倍。破菌缓冲液ＴｒｉｔｏｎＸ－１００２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ．１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ１００ｍｍｏｌ／１Ｔｒｉｓ’ＨＣＩ（ｐＨ８．０）ｌＯｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ１ｍｍｏＵｌＰＥＧ４０００５０％ＰＥＧ８０％（ｖ／ｖ）ＩＯｘＴＥ（ｐＨ７．５）ｌＯ％（ｖ／ｖ）１０ｘＬｉＡｃ贮液１０％（ｖ／ｖ）ＬｉＡｃ溶液：１．０Ｍ，过滤除菌葡萄糖溶液：４０％，１１５℃灭菌３０ｍｉｎ１９第二章将目的基因转入酿酒酵母半乳糖溶液：４０％，１１５＂Ｃ灭菌３０ｍｉｎＳＴＥＴ８％蔗糖，０．１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５０ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ，５０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ?ＨＣｌ，ＣａＣｌ２溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ），取０．１ｍｏｌＣａＣｌ２溶于去离子水中，定容至１０００ｍｌ。苯酚：氯仿（１：ｌｖ／ｖ，无需灭菌，冷藏保存）ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）２００ｒａｌ５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓａｒｉｅｌ（ｐＨ８．０），２ｍｌ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），定容至１０００ｍｌ。ＣＴＡＢ（５％）称取５克ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ溶于适量水中，加热溶解后定容至１００ｍｌ。溶菌酶（５０ｍｇ／ｍ１）取５０毫克溶菌酶溶于ｌｍｌ水中。ＮａＣＬ（１．２Ｍ）称取７．０１２８克ＮａＣＬ，溶于适量水中，溶解后定容止ｌＯＯｍｌ。２．１．５培养基ＬＢ（Ｌｕｒｉａ—Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基：２０天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究液体：１％胰化蛋白胨，０．５％酵母提取物，１％ＮａＣｌ，调ｐＨ＝７．５，１２１＂Ｃ下灭菌１５ｍｉｎ。冷却至室温加入氨苄青霉素（ｈｍｐｉｃｉｌｉｎ）至终浓度为１９氨苄青霉素／Ｌ培养基。固体：在调好ｐＨ值的液体培养基中加入１．５％的琼脂粉，１２１℃下灭菌１５ｍｉｎ，冷却至室温加入氨苄青霉素至终浓度为ｌｇ氨苄青霉素／Ｌ培养基。ＹＰＤ培养基：液体：１％酵母提取物，２％蛋白胨，ＰＨ自然，１２１＂Ｃ下灭菌１５ｍｉｎ，再加入单独灭菌的４０％葡萄糖至终浓度为２％。固体：在ＹＰＤ液体培养基中加入１．５％（ｗ／ｖ）琼脂粉，．１２１。Ｃ下灭菌１５ｍｉｎ。完全极限省却成分培养基（ＣＭ）：ＹＮＢｗ／ｏＡＡ：０．６７％，葡萄糖：２％，Ｄｒｏｐｏｕｔｐｏｗｄｅｒ：０．０８３％，其中含（ｍｇ／Ｌ）：酪氨酸３０谷氨酸１００甲硫氨酸２０精氨酸２０．缬氨酸１５０丝氨酸Ｊ５０苯丙氨酸５０苏氨酸１５０赖氨酸３０天冬氨酸１００异亮氨酸３０其它营养成分（ｍｇ几）：腺嘌呤５０亮氨酸１００尿嘧啶５０?色氨酸１００组氨酸１００省却特定的氨基酸成分，液体培养基ｐＨ５．６，固体培养基加１．５％的琼脂粉，ｐＨ６．５１２１℃下灭菌１５ｍｉｎ。产孢培养基：液体（ｗ／ｖ）：ＫＡｃ１％，酵母提取物０．１％，葡萄糖０．０５％。２１