第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
第一节 分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制
在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见表13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branched chain amino acids）。分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。
表13-1 分枝链氨基酸的结构 名称 结构式 分子式 分子量 异亮氨酸（Ile） C6H13O2N 131.18 亮氨酸（Leu） C6H13O2N 131.18 缬氨酸（Val） C5H11O2N 117.15 Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。
表13-2 Ile的四种光学异构体
L-Ile D-Ile D-别Ile L-别Ile 一、生物合成途径 1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记
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的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。出于VaI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，Val及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。Ile的六个碳原子中的四个碳原子来自于ASP，所以，Ile与Thr、Lys、Met一起，亦称作ASP族氨甚酸。Umbarger等研究的结果，清楚地说明，不仅L-Thr是Ile的前体，D-Thr及α-氨基丁酸也是Ile的前体。并且指明，由D-Thr等物质生成α-酮基丁酸的酶，不受反馈抑制。因此，可以用D-Thr或α-氨基丁酸发酵制造Ile。
分支链氨基酸的生物合成途径如图13-1所示。
图13-1 分支链氨酸生物合成途径及其调节机制
由图13-1可以看出，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸这3种分支链氨基酸是从苏氨酸、丙酮酸经过若干步酶促反应而合成的。可以看出，L-苏氨酸是异亮氨酸的直接前体，丙酮酸是缬氨酸的直接前体，由缬氨酸合成途径的中间体α-乙酰异戊酸分支合成亮氨酸。在合成异亮氨酸、缬氨酸的途径中，有4步反应的酶是共用的，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶、二羟基脱水酶及分支链氨基酸转氨酶。它们分别催化异亮氨酸及缬氨酸生物合成途径中互相对应的反应。例如，乙酰乳酸合成酶既催化异亮氨酸合成途径中由α-酮丁酸生成，α-乙酰-α-羟基丁酸的反应，又催化缬氨酸合成途径中由活性乙醛和丙酮酸生成α-乙酰乳酸的反应。此外，分支链氨基酸转氨酶不仅能催化异亮氨酸和缬氨酸的合成，而且也能催化亮氨酸的合成，也就是说，异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的最后一步转氨基反应，都是由同一种转氨酶催化完成的。
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二、代谢调节机制
研究表明，在粘质赛氏杆菌中，分支链氨基酸生物合成的代谢调节机制如图13-2所示。
图13-2 粘质赛氏杆菌中分支链氨基酸生物合成的调节机制
由图13-2可以看出，Ile合成中的第一个限速酶是L-Thr脱氨基酶，第二个限速酶则是乙酰羟基酸合成酶。Va1合成中的限速酶是乙酰基酸合成酶，也就是Ile合成中的第二个限速酶。Leu合成中的限速酶是α-异丙基苹果酸合成酶。限速酶的不同，就意味着目的产物合成所受的代谢调节不同。然而，随着微生物种类的不同，限速酶的调节因子也不同，就现有的研究情况来说，粘质赛氏杆菌的代谢情况了解得较为全面，这种细菌的分枝链氨基酸合成的代谢调节方式，跟大肠杆菌相类似。其他菌种的代谢调节方式只是部分地了解。分支链氨基酸生物合成的代谢调节机制如下。
(1)苏氛酸脱氨酶受异亮氨酸的反馈抑制。 (2)α-乙酰乳酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制。 (3)α-异丙基苹果酸合成酶受亮氨酸的反馈抑制。
(4)分支链氨基酸合成酶系的各个酶的生成，受这3种末端氨基酸——异亮氨酸+缬氨酸+亮氨酸的多价阻遏。
编码3个分支链氨基酸合成酶系的基因组成两个主要的操纵子：ilv(左)和1eu(右)操纵子（图13-3 )。位于图距85min的ilv GEDACB操纵子中，DACB基因编码异亮氨酸、缬氨酸2个途径共用的4个多功能酶：基因C和D编码乙酰乳酸异构还原酶的亚基和二羟基脱水酶。基因B、G和E则分别编码乙酰乳酸合成酶亚基Ⅰ、Ⅱ和缬氨酸转氨酶。基因A编码苏氨酸脱氨酶。它们的控制区也分别处在B与C、C与A和E与G基因之间。亮氨酸合成途径酶系由leu操纵子编码：基因A编码异丙基苹果酸合成酶，基因D、C编码α-异丙基苹果酸异构酶，基因B编码β-异丙基苹果酸脱氢酶。leuDCBA操纵子被靠近结构基因A的调节区所控制。处于图距2min的ilvH、I操纵于编码同功酶乙酰乳酸合成酶亚基Ⅲ。
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图13-3 大肠杆菌leu（右）ilv(左)操纵子的组织结构
在ilv GEDACB操纵子中，转录时GEDA产生一条mRNA，而C和B则不和它一起转录。编码Ⅲ型合成酶的结构基因ilv H、I则位于2min处，但都受该途径终产物的阻遏。此外，所有的结构基因产物都可能受到多价阻遏，但是，无论是用遗传的方法还是生化的方法都未能鉴定出阻遏物，所以目前认为ilv和leu操纵子表达的控制可能主要通过衰减机制。
1eu操纵子控制区的全部核苷酸序列已经测出。经分析发现，Pribnow box居于前导转录物起始转录位点之前，此前导转录物具有编码28个氨基酸残基的能力。其上含有的4个连续的leu密码子，无疑也是在翻译水平上起调节作用的、除非亮氨酰－tRNAleu与翻译的核搪体处在这点(指4个leu密码子处)上空转时被隔离开来。如此，转录便向前，一组基因开始表达。另外，还含有3个异亮氨酸和3个缬氨酸密码子，显示着前导肽上这些氨基酸的有效性可能影响1eu操纵子的表达。
1eu前导转录物除含有能够产生前空白子(A—A)、终止子(B—B)和保护子(D—D)的二级结构外，还存在一种能阻止前空白于形成并且引起操纵子衰减的附加序列(additionalsequence)D—D。由于D—D首先形成，此操纵子将会总是处于衰减状态，除非核糖体在那里破坏D—D配对，并且A—A也不配对。运转的核糖体需要精确的密码排列，如果只在leu密码子处发生空转，那么在加个ilv－val第一个双密码子处空转的核糖体不能使操纵子去阻遏，而且在第二个ilv-val双密码子处空转的核糖体也都不能去阻退，因为它阻止了前空白子(A—A)的形成。这就对多价阻遏产生了某些怀疑，实际上，这很可能就是多价衰减。
ilv操纵子表达的程度好像取决于一个以上核糖体沿前导RNA的移动速率，而亮氨酰、缬氨酰和异亮氨酰－tRNA的有效性决定着这种移动速率。核糖体的移动将促进前导转录物结构上发生动力学的变化，显示着可能引起终止子茎环结构的形成。当所有氨酰-tRNA都存在时，核糖体沿前导肽平滑地移动，直到它遇上隐藏终止密码的碱基配对形成茎环结构Z—Z为止。这种终止便给出了足够的时间形成终止子，以致发生衰减作用。
第二节 异亮氨酸发酵
1901年，Fischer在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大的物
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质，此为有关L-异亮氨酸的最早报道。L-异亮氨酸（L-Isoleucine），化学名为β-甲基-α-氨基戊酸。由于在α位和β位具有两个不对称碳原子，因而存在D、L、D别、L别四种旋光异构体，但自然界中存在的异亮氨酸为L-异亮氨酸，其余三种均无营养价值。由于存在四种旋光异构体，因此很难采用化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，廉价制造高纯度L-异亮氨酸，只有采用发酵法。然而，自然界中只找到了分泌L-亮氨酸和L-缬氨酸的菌株，却未发现分泌L-异亮氨酸的菌株。直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成体系反馈调节机制的全部搞清，才人工选育出L-异亮氨酸产生菌。 一、L-异亮氨酸生产方法
L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的主要是发酵法。由于化学合成法生产的L-异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而未能实现工业化生产。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。
1添加前体物发酵法
又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。
图13-4 L-异亮氨酸合成前体
由于其前体物质稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-异亮氨酸。 2直接发酵法
直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium Lactofermentas）诱变选育而来。 二、 L-异亮氨酸生产概况
目前国际上日本生产L-异亮氨酸占有垄断地位，厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达30~35g/L，提取率60~70%。目前全世界合计年产量400~500吨。鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸。我国的L-异亮氨酸发酵研究始于20世纪70年代，90年代初正式工业化生产。目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为20~22g/L，总得率为40~50%。与日本相比较，我国的L-异亮氨酸生产水平还较低 (如表13-3所示)。
表13-3 我国与日本L-异亮氨酸发酵技术指标的比较
生产技术指标 产酸率(g/L) 对糖转化率(%) 提取收率(%)
日本 30~35 20~25 60~75
中国 20~25 13~15 60
三、L-异亮氨酸产生菌育种策略及实例
（一） L-异亮氨酸产生菌常规育种策略
根据L-异亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制（如图13-1和图13-2所示），L-异亮氨酸高产菌应具备以下生化特征：
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