第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
增加到1.1时，维持在30%以上之后，维持在20%左右，植物油作为消泡剂, 发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后糖液维持残糖在1.5～2.5之间。发酵80h可产异亮氨酸24.5g/L。
第三节 亮氨酸发酵
L-亮氨酸（L-leucine，Leu）是Proust于1819年首先从奶酪中分离出来的，以后Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L-亮氨酸是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料。L-亮氨酸对维持危重病人的营养需要，抢救患者生命起着积极作用。L-亮氨酸可用于诊断和治疗小儿突发性高血糖症和作为头晕治疗及营养滋补类药物。L-亮氨酸还可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制细菌生长等生物活性的L-亮氨酸Schiff碱Cu（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）配合物。最新研究表明：由L-亮氨酸合成的多聚物，是临时创伤敷料的最佳原料之一，极具发展潜质。 一、L-亮氨酸的生产方法
L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、添加前体发酵法、直接发酵法等。 1 提取法
L-亮氨酸在蛋白质中含量较多，将干酪素、角蛋白、血色素在酸性条件下水解，用碱中和即有亮氨酸沉淀，用β-萘矾酸使沉淀结晶，用离交法、层析法分离。国内虽有由天然蛋白质水解液分离提取L-亮氨酸产品，但该方法工艺费时、收率低，不适合大规模工业化生产。
2 化学合成法
化学合成法又分Storeker法、α-卤代酸法等。前法是将异戊醛制成氰醇再制成氨基腈后水解，或将异戊醛先制成乙内酰尿衍生物后加压加热水解；后法是将异己酸在三氯化磷存在的情况下加入溴生成α-溴异己酸，再与氨作用生成亮氨酸。
3 发酵法
发酵法是利用微生物菌体的生物合成作用，过量积累L-亮氨酸的过程。包括微生物转化法和微生物直接发酵法。
1）微生物转化法 又称添加前体发酵法。利用葡萄糖为发酵碳源、能源，再添加目的氨基酸的前体物，经特定微生物的代谢转化作用将该前体物有效地转化为目的氨基酸。德国学者Ulrich Groeger采用分批流加培养法，流加生物合成L-亮氨酸的前体物α-酮基异己酸32g/L，经谷氨酸棒杆菌ATCC13032发酵23小时，产L-亮氨酸24g/L。
2）微生物直接发酵法 利用微生物能自身合成L-亮氨酸的能力，通过对出发菌株（通常用谷氨酸产生菌如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等）的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。以微生物直接发酵法生产L-亮氨酸，在国外（如日本）已形成一定规模的工业生产能力。
二、L-亮氨酸产生菌代谢控制育种策略及实例
（一） L-亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制
由图13-1可知，L-亮氨酸的生物合成途径从丙酮酸开始直至形成α-酮基异戊酸，与L-缬氨酸的相应合成途径完全相同。丙酮酸在乙酰羟基酸合成酶的催化下，与来源于丙酮酸的活性乙醛基缩合形成α-乙酰乳酸。活性乙醛基是乙醛基与α-羟乙基硫胺素焦磷酸结合的产物。α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶催化下发生甲基自动位移形成α，β-二羟基异戊酸。该产物经二羧酸脱水酶催化脱水后形成L-缬氨酸相应酮酸—α-酮基异
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戊酸。α-酮基异戊酸在α-异丙基苹果酸合成酶的作用下，接受由乙酰CoA转来的酰基形成α-异丙基苹果酸。α-异丙基苹果酸在α-异丙基苹果酸异构酶作用下形成β-异丙基苹果酸，再经以NAD为辅助因子的β-异丙基苹果酸脱氢酶作用形成α-酮基异己酸。α-酮基异己酸由支链氨基酸转氨酶催化与谷氨酸转氨形成L-亮氨酸。
L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制如图13-2所示。丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸间接前体物。催化丙酮酸生成α-酮基异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的，这些酶的合成均受到三种支链氨基酸的协同反馈阻遏。其中的乙酰羟基酸合成酶是由丙酮酸合成α-酮基异戊酸的关键（限速）酶，还受到L-缬氨酸的反馈抑制。在由α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸过程中，α-异丙基苹果酸合成酶是关键（限速）酶，受到L-亮氨酸的反馈抑制和阻遏。
乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸的亲和力比对丙酮酸的高。α-异丙基苹果酸合成酶对α-酮基异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对α-酮基异戊酸的亲和力约高十倍。所以，三种支链氨基酸生物合成的优先顺序为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。据此可知，在α-酮基丁酸之前减弱或切断异亮氨酸的代谢流，对亮氨酸的优先合成有重要作用。
大肠杆菌分支链氨基酸合成酶系的基因组成如图13-3所示。大肠杆菌细胞中由丙酮酸生成L-亮氨酸的酶系受到两个主要的操纵子（ilv操纵子和leu操纵子）的调控。ilv操纵子中的DACB基因编码合成三种支链氨基酸共用的3个多功能酶。从α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸的酶系，是由leu操纵子中的DCBA基因编码的：基因Ａ编码α-异丙基苹果酸合成酶，基因Ｂ编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，基因Ｄ、Ｃ编码α-异丙基苹果酸异构酶。leuDCBA操纵子被靠近结构基因Ａ的调节区所控制。
（二）L-亮氨酸育种策略 1. 出发菌株的选择 目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道。
2. 解除反馈抑制与阻遏
根据L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制，要通过代谢控制育种手段获得L-亮氨酸高产菌，必须实现三个解除一个改变：
① 解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟基酸合成酶等3个共用酶的协同反馈阻遏作用；
② 解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用；
③ 解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏作用。以上可通过使菌体带上L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记(如：2-TAr、α-ABr、β-HLr、Valr、LeuHxr等遗传标记)来实现。
④ 改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。这可通过使菌体带上某些药物类(如：SGr等遗传标记)或抗生素类抗性标记(如：Rifr等遗传标记)来实现。
结构类似物（代谢拮抗物）的作用机理是：正常细胞合成代谢的最终产物对于有关酶的合成具有阻遏作用，对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用。这是由于终产物能与阻遏蛋白或变构酶相结合的缘故。由于这种结合是可逆的，所以当代谢最终产物例如L-亮氨酸，参与代谢而在细胞内浓度降低时，它就不再与阻遏物以及变构酶相结合，
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这时有关酶的合成以及它们的催化作用便又可继续进行。代谢拮抗物由于与代谢产物结构相似，所以同样能与阻遏物以及变构酶相结合，可是它们往往不能代替正常的L-亮氨酸而参与蛋白质的合成，也就是说它们在细胞中的浓度不会降低，因此与阻遏物以及变构酶的结合是不可逆的。这使得有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。表现为菌株在添加有临界浓度以上的结构类似物的培养基中不能生长。
2-噻唑丙氨酸（2-TA）是L-亮氨酸和L-缬氨酸的结构类似物，通过选育2-TAr抗性标记，有利于解除乙酰羟基酸合成酶和α-异丙基苹果酸合成酶所受到的反馈抑制和阻遏。α-氨基丁酸（α-AB）是缬氨酸的结构类似物，选育α-ABr有利于解除缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。亮氨酸氧肟酸盐（LeuHx）和β-羟基亮氨酸（β-HL）是亮氨酸的结构类似物，选育LeuHxr和β-HLr等抗性标记，均有利于解除终产物亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系所受到的反馈抑制和阻遏，从而大幅度地提高L-亮氨酸的产量。2-TAr和β-HLr这两个标记，对L-亮氨酸高产菌的育种非常重要。
筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸产生菌选育上具有普遍提高产酸能力的作用，关于其详细机制，尚未见到令人信服的报道。一般认为，磺胺胍是细菌的生长因子——对氨基苯甲酸（PAPA）的结构类似物，而PAPA是叶酸的一个组分，不少细菌要求外界提供PAPA以合成其代谢中必不可少的辅酶—四氢叶酸，因而二者起竞争性拮抗作用。一旦菌株带有磺胺胍抗性标记，菌体的正常代谢发生改变，从而导致像氨基酸这样的代谢产物大量的积累。
图13-5 几种结构类似物的结构式
筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸产量提高，其机制尚不清楚，可能是通过改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。利福平为半合成广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核分支杆菌均有明显抗菌效应。抗菌机理是：通过与细菌RNA聚合酶的β亚基结合，抑制细菌RNA聚合酶的活性，妨碍细菌RNA转录的启始。但是RNA转录一旦开始，利福平则不起作用。
人们还发现：结核分支杆菌耐利福平与细菌RNA聚合酶的β亚基编码基因rpoB的突变有关。rpoB基因全长3543个碱基，当其中有81个碱基的核心区域发生突变时，利福平不能与RNA聚合酶β亚基结合，导致细菌对利福平耐受。黄海荣等通过对rpoB基因588bp易变区进行DNA序列分析，报道了我国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的特点：193株耐利福平临床分离株中有172株存在rpoB基因核心区域的点突变，突变率为89.1%（172/193）；46株利福平敏感株均未检测到核心区域的突变。突变类型包括39种，涉及了24个碱基，15种氨基酸。有86个耐利福平菌株的点突变位于11223位碱基，发生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换，使531位丝氨酸转换为亮氨酸，占所有菌株的44.6%(86/193)。另一个比较常见的发生突变的氨基酸是位于526位的组氨酸，其突变率是17.1%(33/193)，其相应密码子CAC的三个碱基都可能发生突变，其中最常见的是第
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一个胞嘧啶，可转换为腺嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶（分别是2/33，9/33，10/33）。531位和526位氨基酸突变率之和是62.3%，在我国结核分支杆菌与耐利福平有关的突变中最为常见。在研究中未发现有缺失或插入类型的突变，说明在我国结核分支杆菌产生耐利福平的主要形式是点突变。利福平的化学结构式为：
筛选L-异亮氨酸缺陷型的回复突变株也可望提高L-亮氨酸产量。因为L-亮氨酸生物合成的关键酶α-异丙基苹果酸合成酶的底物专一性宽，也能以丙酮酸为底物，催化丙酮酸生成α-甲基苹果酸，该酶受L-亮氨酸的反馈抑制。α-甲基苹果酸可在解除阻遏的L-亮氨酸生物合成酶系催化下，经过几步酶促反应生成α-酮基丁酸。因此，解除了L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶反馈抑制的突变株，可利用该酶底物专一性宽(特异性不强)的特性，从丙酮酸生成α-酮基丁酸，α-酮基丁酸通过异亮氨酸、缬氨酸酶系转变成L-异亮氨酸，表现为L-异亮氨酸缺陷型的回复突变。在L-异亮氨酸缺陷型的回复突变株中，可能混有L-苏氨酸脱氨酶的回复突变和α-异丙基苹果酸合成酶对反馈抑制脱敏的两种类型突变株，可通过亮氨酸缺陷型的生长谱法加以认别。
3. 减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成
基于丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸的间接前体物，因此，在增大丙酮酸合成代谢流的同时，应使α-酮基异戊酸主要流向L-亮氨酸。从图13-1的代谢途径可知，欲切断α-酮基异戊酸合成L-缬氨酸这一代谢支路来选育L-亮氨酸高产菌是行不通的。因为催化合成三种支链氨基酸的转氨酶是同一个酶。因此，从选育营养缺陷突变株的角度看，只能通过选育异亮氨酸缺陷突变株来解除3个共用酶受所到的反馈阻遏。在亮氨酸反馈调节脱敏的L-亮氨酸高产菌中，该酶能优先利用α-酮基异戊酸来大量合成L-亮氨酸，但当菌体自身合成缬氨酸的量或培养基中添加的缬氨酸的量偏低，L-亮氨酸高产菌很容易发生回复突变，表现为产酸不稳定和产率下降。
选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-亮氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-亮氨酸产量的提高。选育以琥珀酸为唯一碳源生长微弱的突变株，即可获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱的突变株。
在乳糖发酵短杆菌中，亮氨酸的生物合成与赖氨酸之间还存在着代谢互锁， 赖氨酸生物合成分支途径的第一个酶（二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶，DDP合成酶）的合成受亮氨酸阻遏。因此，L-亮氨酸的大量积累会引起赖氨酸生物合成途径上的DDP合成酶的合成受到阻遏，从而使丙酮酸通向赖氨酸的代谢受阻。另外，有研究报道，L-亮氨酸生物合成的限速酶α-异丙基苹果酸合成酶，在1mmol/L亮氨酸存在下80%受抑制，而添加1 mmol/L赖氨酸之后，即可恢复，而且赖氨酸可促进该酶的活性。
4. 切断进一步代谢途径
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要大量积累L-亮氨酸，需切断或减弱亮氨酸进一步向下代谢的途径，使合成的亮氨酸不再被消耗，如选育以L-亮氨酸为唯一碳源不能生长或生长微弱的突变株。
5. 利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌
基因工程技术主要通过目的基因扩增，增加生物合成途径中的限速酶，以提高目的产物的产量。从L-亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制可知，α-异丙基苹果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途径中真正意义上的限速酶，将编码该酶的基因克隆到L-亮氨酸产生菌中，增加该酶的数量，以解除其“瓶颈”的限速作用，从而提高L-亮氨酸的产量。
综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、异亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；结构类似物抗性，如： 2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、β-羟基亮氨酸抗性（β-HLr）、亮氨酸氧肟酸盐抗性（LeuHxr）或缬氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等。L-亮氨酸高产菌的整体育种策略如图13-6所示。
图13-6 L-亮氨酸高产菌育种策略图
（三）L-亮氨酸产生菌的育种实例
Kisumi等由粘质赛氏杆菌异亮氨酸缺陷型菌株选育α-氨基丁酸（α-AB）抗性时，意外获得异亮氨酸缺陷的回复突变株，在10%的蔗糖培养基中可发酵积累L-亮氨酸10~13.5g/L。
Tsuchida等将乳糖发酵短杆菌2256进行诱变，获得具有2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）兼蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷(Met-+Ile-)突变株No.218，在13%的葡萄糖培养基中可积累L-亮氨酸28g/L。证明了该菌株已解除了L-亮氨酸对其生物合成的第一个酶—α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏。Akashi等研究了通风等条件对产酸率的影响，在最佳条件下该菌株产酸率可达30g/L。
张素鑫等由钝齿棒杆菌AS1.542经NTG连续诱变处理，选育得到一株L-亮氨酸产生菌AS1.1004，可产14g/L的L-亮氨酸。张素珍等继续以AS1.1004为出发菌株，经NTG和快中子处理后获得变异株L-421（L-异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性，Ile-+2-TAr），在2000L发酵罐上，于30℃发酵40h，可产L-亮氨酸20g/L。
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