第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
宫锦芗将黄色短杆菌T6-13经多次诱变处理，并结合氨基酸结构类似物的筛选，最终获得一株具有苏氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性、β-羟基亮氨酸抗性及缬氨酸抗性(Thr-+2-TAr+β-HLr+Valr)的L-亮氨酸产生菌920-36，在最佳条件下，该菌株可在发酵液中积累13.5g/L的L-亮氨酸。
Tsuchida等还采用亚硝基胍（NTG）诱变等方法处理乳糖发酵短杆菌2256，最终选出一株L-亮氨酸高产菌（34号菌, Ile-+2-TAr+β-HLr），可在13%葡萄糖培养基中积累L-亮氨酸34g/L。
李彤等从钝齿棒杆菌中分离获得一株能稳定高产L-亮氨酸的菌株B20-1，其遗传标记为Pro-+ 2-TAr+ N-Leur+ N-Valr+ LeuHxr+ DL-N-LeuHxr，产酸可达15g/L。
刘党生等采用紫外线诱变处理天津短杆菌T6-13，选育得到一株L-亮氨酸产生菌No.145，其遗传标记为AHVr+Rifr，可产21.8g/L的L-亮氨酸。
齐秀兰等分别以黄色短杆菌T6-13、黄色短杆菌CF-435为出发菌，利用紫外线、氯化锂对其原生体进行复合诱变，选育得到两株L-亮氨酸产生菌57-4S、UV3-29，其遗传标记为Rifr，可产23.45g/L、26.73g/L的L-亮氨酸。
伍时华等利用原生质体融合技术定向选育的黄色短杆菌TQ9806（Met-+2-TAr+ α-ABr+β-HLr+SGr），可产22.7g/L的L-亮氨酸。
陈宁等以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）HL41（CICC 10135）为出发菌种, 通过硫酸二乙酯（DES）和紫外线诱变处理，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代，筛选出一株L-亮氨酸生产菌株TK0303（Met-+ IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr + Rifr +SGr），该菌株发酵60h可产L-亮氨酸36g/L。 三、L-亮氨酸的发酵过程控制
以天津科技大学陈宁等选育的L-亮氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TK0303（Met-+ IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr + Rifr +SGr）为例，介绍发酵法生产L-亮氨酸的工艺。吸取无菌水于10支试管（18×180）生长良好的活化斜面试管中，将所有菌悬液全部接入5L种子罐中的1500ml种子培养基[种子培养基成分（g/L）：无水葡萄糖37，豆饼水解液25mL，尿素2(分消后补加)，KH2PO4·3H2O 1.3，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，L-Met 0.4，VB1 300μg，VH200μg，pH7.0~7.2 0.075MPa 20min]，搅拌转速300~500 r/min，维持溶氧在20%左右，通过自动流加氨水和稀盐酸控制pH在7.0，培养温度28℃，培养至对数生长中后期，约26h转发酵，此时，菌体净增浓度△OD620nm在0.6以上。
按10%的接种量将种子液600mL接入装有5.4L发酵培养基的10L发酵罐中；发酵培养基成分为（g/L）：无水葡萄糖80，玉米浆46mL，(NH4)2SO4 20，NH4Ac 12， KH2PO4·3H2O 1.3，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.01, L-Met 0.7，L-Ile 0.060，L-Glu 0.40，VB1 160μg，VH 50μg，柠檬酸钠2.5， pH7.0~7.2 0.075MPa 20min。通风量和搅拌转速根据溶氧的要求调节，通过控制不同的搅拌转速和通风量来控制不同的体积溶氧水平。发酵过程溶氧控制为：0-10h，30%以上；10-16h，10-20%；16h以后，控制溶氧在0-5%之间（以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0，以空气中的溶氧为100%）。通过自动流加25%的氨水控制pH在7.0；培养温度28℃；植物油作为消泡剂, 发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后冷却到28℃的糖液维持残糖在1.5～2.5之间，发酵过程中每隔4h取样进行各种参数测定。发酵60小时左右，可产L-亮氨酸36g/L。
第四节 缬氨酸发酵
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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
L-缬氨酸（L-valine）于1901年从酪朊蛋白中发现，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸属于分支链氨基酸（branched chain amino acid, BCAA），是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，主要用于食品、调味剂、动物饲料和化妆品的制造以及配制复合氨基酸输液、合成多肽药物和食品抗氧化剂等，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。它在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合，肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。随着其研究的不断深入，应用范围也将进一步扩大。因此，L-缬氨酸的生产具有非常广的应用前景。 一、L-缬氨酸的生产方法
目前，L-缬氨酸的生产方法有提取法、合成法、发酵法等。 1提取法 动物血粉、蚕蛹及毛发水解液中L-缬氨酸的含量较高，从动物血粉和蚕蛹水解液中，应用离子交换技术从混合氨基酸中分离L-缬氨酸，分离的效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高，不适合于现代化大工业生产。猪血粉中提取L-缬氨酸的回收率为14.7%；蚕蛹水解液中分离L-缬氨酸，回收率为23.68%。
2合成法
合成法很多，一种是由异丁酸与氨生成氨基异丁醇，再与氰化氢合成氨基异丁腈，然后水解而成。一种是由异丁醛与氰化氢合成羟基异丁腈，再与氨作用生成氨基异丁腈，水解得DL-缬氨酸，经化学法或酶法拆分得L-缬氨酸。也可由异丁醛与氰化钠和氯化铵直接合成氨基异丁腈，再水解而成。上述三种方法的得率为36%～40%。合成法所得为外消旋体，须经外消旋拆开。旋光拆开的方法很多，如用酰基-DL-氨基酸的酶进行水解，再利用游离氨基酸与酰化体的溶解度差进行分离。化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。
3 发酵法
利用微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低，反应条件温和及易实现大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。
1） 添加前体物发酵法
又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。由于其前体物质如丙酮酸等稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-缬氨酸。
2）直接发酵法
直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，世界上L-缬氨酸均采用直接发酵法生产。国外曾对发酵法所用L-缬氨酸优良生产菌的诱变育种和代谢调控作了一些研究，而国内尚处于研究与小规模生产阶段，菌株产酸水平不高，生产水平和产量远不能满足市场需求。因此，以微生物发酵法生产L-缬氨酸的研究具有重要的意义。
二、L-缬氨酸生产菌的育种策略与育种实例
（一）L-缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制
L-缬氨酸的生物合成途径如图13-1所示，由图13-1可知，L-缬氨酸的生物合成途径是从丙酮酸开始，经过几步反应形成L-缬氨酸。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下形
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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶的催化下发生甲基自动移位，形成α，β-二羟基异戊酸。该产物经二羟基脱水酶催化脱水后形成α-乙酰异戊酸，α-乙酰异戊酸在转氨酶的作用下形成L-缬氨酸。
丙酮酸是L-缬氨酸的直接前体物，催化丙酮酸生成α-乙酰异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的。这些酶的合成均受到三种分支链氨基酸的协同阻遏。其中α-乙酰乳酸合成酶是L-缬氨酸生物合成途径中的关键酶，受到L-缬氨酸的反馈抑制。此外，L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的最后一步转氨反应都是由同一种转氨酶催化完成的。由于限速酶的活性不仅受产物浓度的调节，也受基质浓度的调节，因此要高产L-缬氨酸就要解除L-缬氨酸本身对关键酶的反馈抑制，解除三种氨基酸对酶合成的多价阻遏。
研究发现，大肠杆菌由丙酮酸生成L-缬氨酸酶系的基因组成两个主要的操纵子，即ilv和leu 操纵子，如图13-3所示。Ilv操纵子包括了ilvG、ilvE、ilvD、ilvA、ilvC和ilvB基因，其中ilvDACB基因编码了合成L-异亮氨酸和L-缬氨酸途径共用的4种同工酶，即二羟基脱水酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰乳酸异构还原酶和乙酰乳酸合成酶，ilvE基因编码L-缬氨酸转氨酶，而ilvG基因编码乙酰乳酸合成酶。为使L-缬氨酸合成反应有效的进行，优选地使用不表达苏氨酸脱氨酶活性的操纵子。可通过诱变野生型的ilvGMEDA操纵子或通过基因重组技术修饰将ilvA操纵子失活或将ilvA基因从ilv中敲除，就可以减弱苏氨酸脱氨酶的活性，切断苏氨酸到L-异亮氨酸的代谢支路，使得代谢途径中的4种同工酶完全用于L-缬氨酸的合成，以提高L-缬氨酸的产量。
埃希氏菌属的微生物由于其生长快、遗传分析研究清楚，被用作L-缬氨酸工程菌的宿主。从诱变的细菌细胞中筛选出不能在以柠檬酸而能在以葡萄糖为唯一碳源的琼脂平板上生长的突变株。进一步诱变筛选出既需硫辛酸又有H+-ATP酶缺失的突变株。通过将调控机制相当松弛的L-缬氨酸生物合成基因引入具有此突变性能的埃希氏菌属微生物可以提高菌株的L-缬氨酸生产能力。将ilvGMEDA操纵子的苏氨酸脱氨酶失活，得到解除型操纵子ilvGMEDA*（A*代表缺失ilvA基因或ilvA编码失活的苏氨酸脱氨酶），将含有解除型ilvGMEDA*操纵子的DNA片段引入需硫辛酸和/或H+-ATP酶缺失的埃希氏菌微生物可得到高产L-缬氨酸的生产菌。
ilvGMEDA操纵子中的ilvG、ilvM基因分别编码乙酰羟酸合成酶同工酶Ⅱ的大亚基和小亚基，除了同工酶Ⅱ（也称为AHASⅡ），还有同工酶Ⅲ（也称为AHASⅢ）。AHASⅢ由ilvIH操纵子编码，该操纵子由编码大亚基（催化亚基）的ilvI和编码小亚基（控制亚基）的ilvH组成。AHASⅢ受L-缬氨酸的反馈抑制。DNA编码的AHASⅢ的突变体小亚基可以具有一种含有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位以及上述突变株的氨基酸序列，只要突变体小亚基能够与大亚基一起显示不受L-缬氨酸的反馈抑制的乙酰羟酸合成酶活性。将突变的ilvH基因导入大肠杆菌，可得到高产L-缬氨酸的微生物。
（二）L-缬氨酸高产菌的育种策略
诱变育种的目的即根据L-缬氨酸的生物合成途径，从遗传学角度选育能解除微生物正常代谢机制的突变株，提高目的产物的产量。根据L-缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制（如图13-2所示），L-缬氨酸工业发酵高产菌株的选育方法如下：
1.出发菌株的选择
目前，世界上利用发酵法生产L-缬氨酸的出发菌株有北京棒杆菌（Corynebacterium pekineise），谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutacium）， 乳糖发酵短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)，大肠杆菌（Escherichia coli），黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens），芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属
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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
（Escherichia）的菌株等，这些菌株均可以作为选育L-缬氨酸生产菌的出发菌株。
2.切断或改变平行代谢途径
Nakazawa等以黄色短杆菌为出发菌株，选育出L-异亮氨酸与L-甲硫氨酸缺陷型突变株，此突变株可以发酵生产L-缬氨酸。Katasurada等以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过选育L-异亮氨酸与L-亮氨酸缺陷型突变株使L-缬氨酸的产量达19~28g/L。由图13-1可以看出，L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，L-缬氨酸、L-亮氨酸与L-异亮氨酸的生物合成途径中共用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育L-亮氨酸、L-异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的共用酶系完全用于L-缬氨酸的生物合成，进而提高L-缬氨酸的产量。同时α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物。切断L-亮氨酸的合成途径不仅可以节省碳源而且解除了菌体生成L-缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏，使α-异丙基苹果酸合成酶脱敏，显著提高L-缬氨酸的产量。
3.解除菌体自身的反馈调节
L-缬氨酸合成中的第一个限速酶—乙酰乳酸合成酶受L-缬氨酸的反馈抑制，同时L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸生物酶系的多价阻遏，必将大大提高L-缬氨酸的积累。为此可选育L-缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除L-缬氨酸的反馈调节。常用的L-缬氨酸结构类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、α-氨基丁酸（α-AB）、氟亮氨酸、正L-缬氨酸等。Tsuchida等选育出了具有β-羟基亮氨酸、β-2噻吩丙氨酸以及1，2，4-三唑丙氨酸抗性的大肠杆菌突变株AJ-11470，以此来解除产物的反馈抑制，从而发酵生产L-缬氨酸。Nakamura等报道选育α-氨基丁酸抗性突变株ATCC221118生产L-缬氨酸，发酵72~96h，L-缬氨酸的产量可达27~37g/L。徐旭东等以乳糖发酵短杆菌XT4为出发菌株，采用亚硝基胍（NTG）诱变处理，获得一株积累L-缬氨酸的高产菌A15，此菌株具有2-噻唑丙氨酸（2-TA）和α-氨基丁酸（α-AB）抗性，摇瓶产酸达33g/L。
SCCH2CHCOOHNH2NCHCH3-CH2-CH-COOHHC2
（α-氨基丁酸 α-AB） (2-噻唑丙氨酸 2-TA) (磺胺胍 SG)
NH2H2N--SO2-NH-CNHNH图13-7几种氨基酸类似物的结构式
4.增加前体物质的合成
由图13-1可以看出L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的L-缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量，可以选育以琥珀酸为唯一碳源生长慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突变株来达到目的。Kyowa等选育出的L-缬氨酸突变株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中进行培养时，对丙酮酸类似物比较敏感，通过选育丙酮酸类似物敏感突变株，降低了丙酮酸脱氢酶的活性，达到了积累丙酮酸的目的。由于丙酮酸的积累有利于高产L-缬氨酸，结果突变株L-缬氨酸的产量大幅度提高。
根据上述选育突变株的几条途径可选育组合型突变株，如营养缺陷型突变株和抗性结构类似物双重突变株，以提高目的产物的产量。张伟国等所选育的L-缬氨酸高产菌XQ-6就是双重突变株，此菌具有L-异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸（2-TA）和α-氨基丁酸（α-AB）抗性以及α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性等标记。发酵培养72h，L-缬氨酸的产量可达40g/L。
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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
5.切断进一步代谢途径
要积累大量L-缬氨酸，需切断或减弱L-缬氨酸进一步向下的代谢途径，使积累的L-缬氨酸不再消耗，可通过选育不能以L-缬氨酸为唯一碳源生长，即丧失L-缬氨酸分解能力的突变株来实现。
6.选育营养缺陷型回复突变株
当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状之后，经过回复突变可以再回复其原有遗传性状，这是因为当某一结构基因发生突变后，结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活。而经过第二次回复突变后，该酶的活性中心结构就可以复原，而调节部位结构常常并没有回复，结果是酶恢复了活性，但是反馈抑制却已解除或并不怎么严重。因此可以利用选育营养缺陷型回复突变株来提高发酵目的产物的产量，例如选育α-乙酰乳酸合成酶缺陷突变株的回复突变株可以解除L-缬氨酸的反馈抑制以及L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸引起的多价阻遏。
7.利用基因工程技术构建L-缬氨酸工程菌
操纵子ilvI、H编码乙酰乳酸合成酶同工酶Ⅲ，受L-缬氨酸的抑制。通过获得ilvH编码的小亚基（控制亚基）的突变体，即具有一个或几个氨基酸DNA的取代、缺失、插入、添加或倒位，它能够与大亚基一起显示乙酰羟酸合成酶活性但已不受L-缬氨酸的反馈抑制，可用于构建高产L-缬氨酸的工程菌。
ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶是异亮氨酸合成的关键酶，因此若获得不表达苏氨酸脱氨酶活性的操纵子，就可以减弱苏氨酸脱氨酶的活性，使得代谢途径中的4种同工酶完全用于L-缬氨酸的合成。可通过诱变野生型的ilvGMEDA操纵子或通过基因重组技术修饰将ilvA操纵子失活或将ilvA基因从ilv中敲除。据报道，埃希氏菌属的微生物因其生长快、遗传分析研究清楚，常用作L-缬氨酸工程菌的宿主。经选育得到一种突变株，其不利用柠檬酸，以葡萄糖为唯一碳源，生长需硫辛酸且具有H+-ATP酶缺失。将ilvGMEDA操纵子的苏氨酸脱氨酶失活，得到解除型操纵子ilvGMEDA*（A*代表缺失ilvA基因或ilvA编码失活的苏氨酸脱氨酶），将此DNA片段引入上述突变株可得到高产L-缬氨酸的基因工程菌。
ilvE基因主要编码L-缬氨酸转氨基酶，Hoechst和Marquardt等将来源于大肠杆菌ATCC11303的ilvE基因片段克隆到pBR322质粒中，将重组质粒转化到大肠杆菌DG30中，所构建的工程菌株可以高产L-缬氨酸。
（三）L-缬氨酸高产菌代谢控制育种实例
在六七十年代国外就进行了L-缬氨酸发酵生产的研究，Nakayama等于1961年选育了具有氨基酸缺陷的L-缬氨酸生产菌；Udaka等于1960年选育了L-缬氨酸生产菌；Tsuchida于1975年选育2-噻唑丙氨酸抗性突变株；Kisumi于1971年选育α-氨基丁酸抗性突变株；在发酵培养基中所积累的L-缬氨酸均在30g/L 左右。
1975年中国科学院微生物研究所氨基酸组使用北京棒状杆菌AS1.299经硫酸二乙酯（DES）诱变处理后，获得一株突变株AS1.586，可积累大量的L-缬氨酸。在500L发酵罐放大试验中，优化条件下发酵43h，L-缬氨酸产量达26.8g/L。
1986年中科院微生物研究所唐任天等利用钝齿棒杆菌AS1.542诱变获得L-缬氨酸产生菌AS1.001，此菌株带有AHVr、Ile-标记，在适宜的条件下，L-缬氨酸积累可达到36g/L。
1988年Mitsubishi等选育出具有DL-氨基丁酸抗性标记的北京棒杆菌，发酵72hL-缬氨酸的产量达20g/L。
1989年沈阳药学院黄海华等以棒状杆菌T6-13野生菌为出发菌株，经紫外线和NTG多次诱变，获得一株新型的L-缬氨酸生产菌104（2-TAr＋AHVr＋β-HLr），其L-缬氨
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