第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
酸产量可达10g/L。
1990年Konickova等用DES诱变北京棒杆菌，选育相应的氨基酸缺陷型突变株，在优化培养基条件下发酵72h，其L-缬氨酸的产量为6~16g/L。
1990年中国科学院微生物研究所的王秀玲等以北京棒状杆菌产L-缬氨酸突变株334为亲株，经NTG诱变，最终获得多重抗性突变株VT-405(Ile-+α-ABr +2-TAr+NLr+NVr)，产酸达28g/L。VT-405再经紫外线和LiCl复合处理，获得A7菌株。A7菌株保留其亲株的遗传特性，未再增加新的标记，产酸为30g/L。采用适宜的供氧和pH控制，进行补料分批发酵，平均产酸率高达36.78g/L。
1991年Mitsubishi-Petrochem等所选育出MJ-233-HS-AEC-1菌株，在30℃培养3天，可产L-缬氨酸12g/L。
1993年Katsurada等以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过选育聚酮化合物（霉酚酸、浅蓝菌素、迷人醇、富伦菌素等）抗性突变株，得到菌株AJ3434、AJ12341、AJ3776和AJ12342，其L-缬氨酸产量可达20g/L、28g/L、19g/L和26g/L。
1994年刁新民等以北京棒杆菌多重抗性突变株125为出发菌株，经多次提取精制条件试验，获得了最佳发酵培养基配方和较佳的生产工艺条件，提取精制得率达95％以上。
1995年江南大学的张伟国等以DES诱变处理黄色短杆菌XQ5122，得到突变株V3-36(Leu-+α-ABr+AHVr)，在10%葡萄糖培养基中可积累L-缬氨酸23g/L。以NTG诱变V4-153，得到一株突变株(Leu-+α-ABr+AHVr+2-TAr)，再进行单菌落分离，得到突变株ZQ-2，能在培养基中积累L-缬氨酸40g/L。
1996年沈阳药科大学药物所来彩霞等以天津短杆菌为出发菌株，采用硫酸二乙酯诱变处理，筛选出一株可以产12.8g/L L-缬氨酸的突变株，经过培养基配方优化试验，该菌株摇瓶发酵产L-缬氨酸达28.6g/L。
1996年Katsurada等又以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，选育以乙酸为唯一碳源的突变菌株和以丙酮酸为唯一碳源丙酮酸类似物敏感性突变珠AV1和AV2，L-缬氨酸的产量分别为39g/L和36g/L，较原始的出发菌株提高了36%。
1999年中国药科大学微生物教研室的徐旭东，以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)XT-4为出发菌株，采用NTG诱变处理，获得了一株积累L-缬氨酸的突变菌株A15(α-TAr+α-ABr)，该菌株摇瓶产酸26.42g/L，条件优化后，可以达到33.1g/L。
2002年江苏华昌集团有限公司的王平以产L-谷氨酸菌乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermenturn)ATCCl3058为出发菌株，经过NTG和DES多次诱变处理，获得一株产L-缬氨酸突变菌株，其遗传标记为Leu-+Ile-+Met-+AHVr+2-TAr，在10%的葡萄糖培养基中产酸达28g/L～30g/L，在含14%葡萄糖培养基上产酸达35g/L。
2002年天津科技大学陈宁等以黄色短杆菌HL41（CICC 10135）为出发菌株，通过硫酸二乙酯（DES）和紫外线诱变处理，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代，筛选出一株L-缬氨酸生产菌株TV2564(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)， 在10L发酵罐上发酵生产L-缬氨酸，发酵64h产酸55g/L。 三、发酵条件的优化
以天津科技大学陈宁等选育的L-缬氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TV2564 (Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)为例，介绍发酵法生产L-缬氨酸的工艺。吸取无菌水于10支试管（18×180）生长良好的活化斜面试管中，将所有菌悬液全部接入5L种子罐中的1500ml种子培养基[种子培养基成分（g/L）：葡萄糖30.0，玉米浆30mL，尿素1.2，酵母粉 4， KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，VB1300?g，生物素200?g，pH7.0~7.2 0.075MPa 20min]，搅拌转速300~500 r/min，维持溶氧在20%左右，通过自动流加氨水和稀盐酸控制pH在7.0，培养温度32℃，培养至对数生长中后
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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵
期，约15h转发酵，此时，菌体净增浓度△OD620nm0.6以上。
按10%的接种量将种子液600mL接入装有5.4L发酵培养基的10L发酵罐中；发酵培养基成分为（g/L）：葡萄糖80，豆饼水解液20mL，玉米浆25mL， (NH4)2SO45，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01, Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1 200?g，生物素 100?g，pH7.0~7.2，0.075MPa，20min。通风量和搅拌转速根据溶氧的要求调节，通过控制不同的搅拌转速和通风量来控制不同的体积溶氧水平。发酵过程溶氧控制为：0-12h，20%以上；12-16h，0-5%；16h后进入快速产酸期，此时溶氧显示值为0，最好控制供氧为发酵菌体最大耗氧的85%左右。通过自动流加25%的氨水控制pH在7.0；16h后调节pH为7.2。培养温度32℃；植物油作为消泡剂, 发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后糖液，维持残糖在1.5～2.0之间，发酵过程中每隔4h取样进行各种参数测定。发酵64小时左右，可产L-亮氨酸54g/L。
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（执笔 徐庆阳）
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