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根据细菌代谢时对氧气要求的不同，可将细菌分为专性需氧菌；微需氧菌；兼性厌氧菌；专性厌氧菌四大类。
专性厌氧菌不能在有氧环境中生长繁殖的原因：缺乏Eh高的呼吸酶（细胞色素和细胞色素氧化酶）；缺乏分解有毒氧基团的酶（超氧化物歧化酶SOD、触酶、过氧化物酶）。
细菌检验技术
1、名词解释：培养基；分离培养；纯培养；菌落；细菌的生化反应；IMViC试验；KIA试验；CAMP试验；荚膜肿胀试验。
⑴ 培养基：由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品称为培养基。
⑵ 分离培养：临床标本中含有多种细菌，可经过划线接种到固体培养基表面分散开，经过18-24小时培养后可得到单个菌落。这种将混杂的细菌在固体培养基表面分散开的培养方法称为分离培养。或：将增菌培养物或含菌量多的标本如粪便、脓汁等，直接在平板上划线分离，将其中的目的菌分离出来的培养方法。
⑶ 纯培养：挑取一个菌落移种到另一培养基中，长出的细菌为纯种，该方法称为纯培养。 ⑷ 菌落：单个细菌在固体培养基上生长繁殖形成的单一的肉眼可见的细菌集团，称菌落。许多菌落融合在一起形成菌苔。
⑸ 细菌的生化反应：用生化试验的方法，检测细菌对各种基质（糖、蛋白质等）的代谢作用以及形成的代谢产物，从而对细菌鉴别的反应。（原理：细菌内所具有的酶不同，因而对营养物质的分解能力也不同，产生的代谢产物也不同，据此可鉴别不同细菌。） ⑹ IMViC试验：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）及枸橼酸盐利用（C）四种试验，常用于肠道杆菌的鉴定，合称IMViC试验。如大肠埃希菌的结果是 ：+ + - -；产气杆菌的结果是：- - + +。
⑺ KIA试验：即双糖铁—半固体培养基，它是一种复合性的检查生化反应的培养基，可检查4种反应，即葡萄糖、乳糖的发酵反应，是否产生H2S，有无动力等。目前多使用国产双糖铁琼脂粉（KIA），比较方便，效果也好，但只能配制成斜面培养基，不能配成半固体培养基，因而无法观察细菌的动力。KIA试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定和鉴别。
⑻ CAMP试验：B群链球菌产生一种细胞外CAMP因子，可增强金黄色葡萄球菌β-溶血素的活性，因此，血平板上，在两菌（B群链球菌与金黄色葡萄球菌）交界处出现箭头状溶血区。该试验主要用于B群链球菌的鉴定。 ⑼ 荚膜肿胀试验：某些细菌的荚膜与同型抗血清作用后增厚变宽，此试验为荚膜肿胀试验。可作为肺炎链球菌等细菌的血清学诊断。
2、简述细菌染色标本检查的基本程序、复染色法基本程序与常用方法。 细菌染色标本检查的基本程序：涂片－→干燥－→固定－→染色。 复染色法基本程序：初染→媒染→脱色→复染
常用方法：革兰染色法和抗酸染色法，尤其是革兰染色法在细菌学检验中有重要意义。
3、革兰染色的原理、染液组成、染色方法、结果判断、影响因素与临床意义。 革兰染色原理：
⑴ 通透性说：主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰阴性菌细胞壁中含有
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较多类脂质，而肽聚糖含量较少。当用酒精脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞脱色，经复染后，染上复染液(复红)的颜色；而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，酒精不易进入菌体脱色，故细胞仍保留初染液(结晶紫)的颜色。
+
⑵ 化学说：G菌菌体含有大量的核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的菌体不易脱色。
+-+-⑶ 等电点说：G菌（PI2-3）低于G菌（PI4-5），G菌带负电荷比G菌要多，G+菌易与带正
电荷的碱性染料（结晶紫）结合牢固，因而不易脱色。
革兰染色染液组成：结晶紫染液、卢戈碘液、 95％乙醇、稀释石炭酸复红。 染色方法：结晶紫染液（初染） 1 分钟，水洗――卢戈碘液（媒染） 1 分钟，水洗――95％乙醇（脱色） 30 秒至 1 分 钟，水洗――稀释石炭酸复红（复染 ）1 分钟 ，水洗后，待干后用油镜进行观察。
结果判断：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。 影响革兰染色的因素：
⑴ 操作因素：涂片的厚、薄；标本是否固定好；染色与脱色时间的长短。
⑵ 染液因素：卢戈碘液放置时间过长； 95％乙醇挥发；结晶紫与草酸铵混合时间太长等。 ⑶ 细菌因素：细菌种类；细菌菌龄。 影响革兰染色的关键步骤是脱色。
革兰染色的临床意义：⑴ 鉴别细菌；⑵ 选择药物；⑶ 与致病性有关。
4、请写出抗酸染色的染液组成、染色方法及染色结果、原理。 染液组成与染色方法：
固定 加温3-5min 脱色
标本 —→ 5%石碳酸复红 —→ 3%盐酸酒精—→美蓝复染—→ 镜检 染色结果：
红色：抗酸性细菌如结核杆菌 兰色：非抗酸性细菌
原理：由于结核杆菌细胞壁中含大量脂质，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后又能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱色，故又称抗酸杆菌。
5、简述细菌细胞壁染色的方法与结果。 方法：
自然干燥 固定15min 3～5min
制片 →→→→ 10%鞣酸 →→→→ 0.5%龙胆紫 →→→→ 镜检 水洗 水洗
结果：有细胞壁的细菌仅菌体周边染成紫色，菌体内部无色；无细胞壁的细菌（如L型细菌）可见整个菌体浓染呈紫色。
6、简述细菌不染色标本镜检的常用方法与用途。 常用方法：压滴法、悬滴法、（暗视野聚光法、相差显微镜检查法等）。 应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式。 注意事项：检测细菌动力时需注意其真正运动还是分子运动，前者时由于鞭毛引起的有方向性的位移，而后者只是在原地颤动，是由于水分子撞击细菌而引起的布朗运动，无鞭毛的细菌也可有此种分子运动。
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7、简述培养基制备的一般程序与原则。
不同的培养基制备程序不尽相同，但配制一般培养基的程序基本相似，分为以下几个步骤： 调配 → 熔化 → 矫正pH值 → 过滤澄清 → 分装 → 灭菌 → 检定/质量检验 → 保存。 培养基的种类很多，但一般制备原则有三条：⑴ 足够和适当的营养成份。⑵ 合适的酸碱度。⑶ 绝对无菌。 培养基灭菌要求：
⑴ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15~30min。 ⑵ 含糖/明胶培养基：113 ℃灭菌15min。
⑶ 鸡蛋、血清培养基：血清凝固器间歇灭菌3天3次（75 ℃30min → 80 ℃30min → 85 ℃30min）。
⑷ 不耐高温的液体成分如血清、尿素、细胞培养液等：滤过除菌。
8、简述在细菌学检验中常用的接种方法有哪些？
细菌接种时，应根据待检标本的种类、检验目的及所用培养基的类型选择不同的接种方法。 ⑴ 平板划线接种法……分离培养，主要用于固体培养基的接种。
★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 ★方法：
★分区划线法：适用于含菌量较多的标本如粪便、脓汁 ★连续划线法：适用于含菌量较少的标本.
⑵ 琼脂斜面接种法：用于纯种增菌、保存菌种或生化反应。 ⑶ 半固体培养基接种法（穿刺接种法）：用于观察细菌动力或生化反应。 ⑷ 液体培养基接种法：用于纯种增菌或生化反应。
⑸ 倾注平板法：用于水、牛乳、饮料、尿液等液体标本及药物、化妆品等的细菌计数。 方法：是将经灭菌生理盐水适量稀释(通常作10-1～10-5稀释)的标本lml，置于灭菌平皿内。注入10～15ml已融化并冷至50℃左右的适宜培养基，凝固后，将平板倒置于37℃培养18～24h，计算菌落形成单位（colony forming unit, CFU）。求出每毫升或每克标本中所含活菌数。1ml 标本中活菌数= 全平板CFU×稀释倍数。
我国规定生活饮用水的标准是：1 ml 水中细菌总数≤100cfu。 ⑹ 涂布接种法 ：用于纸片药敏试验和生物制品菌苗的生产。
9、简述细菌的培养方法有哪些？
根据不同标本及培养目的的不同，可采取不同的方法进行培养，常用的有普通（一般）培养法（又叫需氧培养法）、二氧化碳培养法、微需氧培养法及厌氧培养法。 ⑴ 普通培养（需氧培养）：
★培养温度：35~37 ℃ （采用恒温培养箱） ★培养时间：18~24h（个别细菌例外） ⑵ 二氧化碳培养法：5~10%CO2。
★ 烛缸培养法：能自动调节CO2的含量和温度，使用较为方便。
★ 二氧化碳培养箱：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处涂以凡士林。
将接种细菌的培养基放入缸中，加盖密封。随燃烧产生的CO2增加，蜡烛自行熄灭，此时缸内CO2浓度约为5%～10%。置37℃孵箱孵育。 ★ 化学法（重碳酸钠-盐酸法）：按每升容积重碳酸钠0.4g与1mol/L盐酸0. 35ml比
例，分别取两试剂置于容器内，放置于标本缸或干燥器内，密封后倾斜容器，使
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盐酸与重碳酸钠接触产生CO2。
⑶ 微需氧培养法： 5~6 %O2 、5~10%CO2和85%N2
有些微需氧菌，如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等，在低氧分压的条件下生长良好。可用抽气换气法即用真空泵先将容器内的空气排尽，然后注入5~6%O2、5~10%CO2、85%N2气体，然后放入37℃孵箱孵育。
⑷ 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等。
10、按物理性状不同可将培养基分哪几种？各有何主要用途并简述细菌在其中的生长现象。
培养基按其物理性状可分为固体培养基、半固体培养基与液体培养基三种。分别观察下列生长现象：
⑴ 固体培养基：细菌得以分离培养生成菌落从而获得纯种，主要用于细菌的分离纯化、鉴定以及药敏试验。菌落分为三型：① 光滑型菌落（S型菌落）；② 粗糙型菌落（R型菌落）；③ 粘液型菌落(M型菌落)。
⑵ 半固体培养基：多用来检查细菌的动力和短期保存细菌。有鞭毛的细菌可由穿刺线向四周运动播散，培养后穿刺线模糊不清，呈羽毛状或云雾状混浊生长；无鞭毛的细菌，不能运动，仅沿穿刺线生长，穿刺线清晰，穿刺线以外的培养基仍透明澄清。
⑶ 液体培养基：主要用于大量繁殖细菌（增菌培养）和观察某些细菌的生化反应。细菌在液体培养基中生长呈三种状态。①混浊生长，见于大多数细菌；②沉淀生长；③菌膜生长，多为专性需氧菌，在培养液表面生长，形成菌膜。
11、按用途不同可将培养基分为哪几种？请各列出一种常用的培养基。 ⑴ 基础培养基：如营养肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等 ⑵ 增菌培养基：
① 通用增菌培养基：如血平板、血清肉汤等。
② 专用增菌培养基：如碱性蛋白胨水用于霍乱弧菌的增菌。
⑶ 选择培养基：如SS平板、伊红-美兰琼脂平板、亚碲酸钾血琼脂平板、TCBS等。 ⑷ 鉴别培养基：如糖发酵管、双糖铁培养基等。 ⑸ 厌氧培养基：如庖肉培养基、硫乙醇酸盐肉汤等。
12、简述甲基红试验、V-P试验、七叶苷水解试验、靛基质（吲哚）试验、硫化氢试验、尿素酶试验、枸橼酸盐利用试验的原理、培养基、方法、结果与应用。 甲基红试验：
原理：葡萄糖 → 丙酮酸 → 大量混合酸 → pH降至4.4以下 → 加入甲基红试剂，培
养基变红为阳性。
培养基：葡萄糖蛋白胨水 试剂：甲基红试剂
方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养2-4d，于培养基内加入甲基红指
示剂2d，立即观察结果。
结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。
应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。如大肠埃希菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。 V-P试验：
原理：葡萄糖 → 丙酮酸 → 脱酸生成中性的乙酰甲基甲醇 → 在碱性环境中被空气中
的氧氧化成二乙酰 → 二乙酰再与培养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍基反应，生成红色化合物为阳性。
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培养基：葡萄糖蛋白胨水
方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35 ℃培养48h后加入甲液(5％α-萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液+0.3 ％肌酐)，振摇。
结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。该试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性
的细菌，后者通常为阴性。
七叶苷水解试验：
原理：某些细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁中的二
价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。 培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。
方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中于35℃培养48h后观察结果。 结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。
应用：主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰
阴性杆菌（克雷伯菌属、肠杆菌属和沙雷菌属）、肠球菌及厌氧菌的鉴别。
靛基质（吲哚）试验：
原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与
试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。 培养基：蛋白胨水培养基
试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）
方法：挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基，于35℃培养24 ~48h后，沿管壁徐徐加入靛
基质试剂0.5ml，使成两层，观察结果。
结果：加入试剂后，两者液面接触处出现红色为阳性；无色为阴性。 应用：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 硫化氢试验：
原理：某些细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸），生成硫化氢，硫
化氢与培养基中的铁盐（硫酸亚铁）或铅盐（醋酸铅）结合生成黑色硫化物（硫化亚铁或硫化铅）。
培养基：克氏双糖铁培养基或醋酸铅培养基 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。
应用：常用于肠道杆菌的鉴别。沙门菌属（甲型副伤寒沙门菌为阴性）、爱德华菌属、
亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等多为阳性，其他菌书呈阴性。
尿素酶试验：
原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。 培养基：尿素培养基（pH6.5-6.8） 试剂：酚红指示剂
方法：将被检菌接种于相应的尿素培养基，于35℃培养18 ~24h后观察结果。阴性时应
继续观察4天。
结果：培养基变红者为阳性；培养基不变色者为阴性。
应用：肠杆菌科中的变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属的鉴定。奇异变形杆菌和普
通变形杆菌、雷极普罗威登菌和摩根菌为阳性；克雷伯菌为弱阳性；大肠埃希菌、斯氏和产碱普罗威登菌为阴性。
枸橼酸盐利用试验：
原理：某些细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐作为
唯一氮源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培
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