·OH + Fe → Fe + OH ·O2- + Fe3+ → Fe2+ + O2
e???净反应：2H2O2 ?F2?2+3+-
2H2O + O2
所产生的·OH与罗丹明-6G作用后使体系的荧光强度下降，荧光强度的变化值与·OH的量有关，由此可以测定·OH的产生量。海南热带兰花水提物的加入会与体系中的罗丹明-6G争夺·OH从而使体系荧光强度减弱程度受到抑制。根据抑制程度来计算几种热带兰花的抗氧化性的强弱。
2.2.2 羟自由基检测
在室温（T=25±2℃）下，在两支10mL比色管中分别加入1.0mL 0.01mmol/L罗丹明-6G溶液，0.18mL 0.1mol/L H2SO4溶液，向其中一支再依次加入0.6mL 1mmol/LH2O2溶液，2.0mL 0.1mmol/L FeSO4溶液，分别加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，反应40min，于λex/λem=346/545nm、入射和出射光谱狭缝分别为5nm和3nm处测定参比溶液荧光强度（Fo）与反应溶液的荧光强度（F），计算试液的荧光猝灭值△F ( △F = Fo–F )并以此间接测定·OH的产生量。
2.2.3 羟自由基清除率的测定
在2.2.2所述体系中加入一定量的羟自由基清除剂（抗坏血酸VC），按2.2.2的操作测定加入羟自由基清除剂后溶液的荧光强度F?，羟自由基清除率的计算方法如下：
错误！未找到引用源。×100％ （2-1）
·2.2.4热带兰花（玉玲珑）的水提物的提取及抗氧化活性研究
运用单因素实验和正交实验考察花瓣的质量, 超声时间，浸泡超声温度三个影响因素对热带兰花（玉玲珑）的水提物的抗氧化活性影响，并筛选了最佳的提取工艺条件。
3 结果与分析
3.1荧光光谱原理分析
在346nm激发光的照射下，罗丹明-6G溶液的最大发射峰位在545nm, Fenton反应产生的·OH可以将其氧化并使荧光强度显著降低，加入羟自由基清除剂(抗坏血酸VC)后，与体系中的罗丹明-6G争夺羟自由基从而使体系荧光强度减弱程度减小，但荧光发射峰位保持不变。荧光光谱如图1所示。
- 3 -
F5001400300200310020500520540560580600波长/nm
1. 罗丹明-6G（aq）+ H2SO4（aq）
2. 罗丹明-6G（aq）+ H2SO4（aq）+ H2O2（aq）+ FeSO4（aq）
3. 罗丹明-6G（aq）+ H2SO4（aq）+ H2O2（aq）+ FeSO4（aq）+VC（aq）
图1 荧光光谱
3.2实验原理验证
取四支10mL比色管，按表1分别加入相应试剂，定容至10mL，摇匀，反应40min，分别测定其荧光强度。实验结果如表1和图2所示。
由表1、图2可得结论，①号样的荧光强度很大，证明罗丹明-6G本身产生了特征荧光；②号样的的荧光强度介于①、③号样之间，说明抗坏血酸（VC）可以·OH反应；③号样的荧光强度最低，说明·OH可以使罗丹明-6G荧光猝灭；④号样与①号样的荧光强度大致相等，证明抗坏血酸（VC）不能和罗丹明-6G反应。
据此可知， Fenton反应生成的·OH可以将罗丹明-6G氧化并使其荧光猝灭，抗氧化剂（VC）与罗丹明-6G争夺·OH，使荧光强度减弱程度降低，而不是对罗丹明-6G的荧光猝灭才导致溶液荧光强度的改变。
表1 实验原理的验证
样品 1 2 3 4
R6G/mL 1.0 1.0 1.0 1.0
H2SO4/mL 0.18 0.18 0.18 0.18
H2O2/mL 0 0.6 0.6 0
FeSO4/mL 0 2.0 2.0 0
VC/mL 0 2.0 0 2.0
荧光强度F 494.8 376.5 38.27 496.3
- 4 -
F50014400300200210030500520540560580600波长/nm1. 罗丹明-6G溶液+ H2SO4溶液
2. 罗丹明-6G溶液+ H2SO4溶液+ H2O2溶液+ FeSO4溶液+VC溶液 3. 罗丹明-6G溶液+ H2SO4溶液+ H2O2溶液+ FeSO4溶液 4. 罗丹明-6G溶液+ H2SO4溶液+VC溶液
图2 实验原理的验证
3.3 实验条件的研究
3.3.1反应时间的影响
按表2加入各种反应试剂，从反应10min起，每隔5min测定一次荧光强度，结果表明，反应30min以内，体系荧光强度随反应时间的增长而下降，反应30min以后，荧光强度下降的趋势变缓。实验数据见表2和图3。
表2 反应时间对荧光变化的影响
样品 1 2 3 4 5 6
R6G/ml 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
H2SO4/ml 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18
H2O2/ml 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
FeSO4/ml 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
时间 10 15 20 25 30 35
F 48.37 40.54 32.93 27.83 25.34 25.34
- 5 -
7 8 1.00 1.00 0.18 0.18 0.40 0.40 2.00 2.00 40 50 25.76 25.67
F50484644424038363432302826241020304050时间/min图3 反应时间对荧光变化的影响
3.3.2 H2O2溶液用量的影响
测量1mmol/L H2O2溶液的加入量分别为为0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL时的各样品的荧光强度。结果表明，当罗丹明6G与H2O2的摩尔比在1:10-1:40范围时荧光强度随着H2O2的加入量的增加而降低，在摩尔比为1：50之后，荧光强度几乎不变。实验数据见表3和图4示。
表3 H2O2溶液用量的影响
样品 1 2 3 4 5 6 7
R6G/ml 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
H2O2/ml FeSO4/ml H2SO4/ml 0.10 2.00 0.18 0.20 2.00 0.18 0.30 2.00 0.18 0.40 2.00 0.18 0.50 2.00 0.18 0.60 2.00 0.18 0.70 2.00 0.18
- 6 -
时间 35 35 35 35 35 35 35 摩尔比 1:10 1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 1:70 F 117.9 57.45 39.50 25.85 20.99 20.38 22.29
8 1.00 0.80 2.00 0.18 35 1:80 20.48
F120100806040201:101:201:301:401:501:601:701:80罗丹明6G与H2O2的摩尔比
图4 H2O2溶液用量的影响
3.3.3 FeSO4溶液用量的影响
测量0.1mmol/L FeSO4溶液的加入量分别为0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00mL、2.40 mL、2.80 mL时的各样品的荧光强度，结果表明，当罗丹明-6G与FeSO4溶液的摩尔比为1:4-1:16范围时，随着FeSO4溶液加入量荧光强度下降较明显，在此之后荧光强度下降较缓。实验数据见表4和图5。
表4 FeSO4溶液用量的影响
样品 1 2 3 4 5 6 7
R6G/ml 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
H2O2/ml 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
FeSO4/ml 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80
H2SO4/ml 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18
- 7 -
时间 35 35 35 35 35 35 35 摩尔比 1:4 1:8 1:12 1:16 1:20 1:24 1:28 F 225.0 107.7 62.13 45.59 33.31 20.70 16.33