中山大学 博士后学位论文
多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究 姓名：陈继平
申请学位级别：博士后 专业：高分子化学与物理 指导教师：张黎明
摘 要 环糊精和温敏聚合物聚Ⅲ．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）对蛋白质的复性均有良 好的促进作用，那么经ＰＮＩＰＡ改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白 质的复性呢？为此，我们将氨基．１３．环糊精（ＥＤＡ．１３一ＣＤ）和带末端羧基的聚Ｎ一 异丙基丙烯酰胺（ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ）偶联得到了一种温敏Ｂ一环糊精衍生物 （１３．ＣＤ．ＰＮｍＡ），分别考察其在不同变性体系、不同１３－ＣＤ。ＰＮＩＰＡ浓度、不同复性 温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）存在下对溶菌酶的复性 效果；通过与ＥＤＡ．１３．ＣＤ和ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的对比分析，揭示了１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分 子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。 实验结果表明：ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿 素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，０．４ｍｇ／ｍＬ的ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ可使ｌ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶的复性率增加至８３．７％，而直接稀释法仅为５５．８％；１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ 对溶菌酶的复性温度应略小于１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度（ＬＣＳＴ，３３．６。Ｃ）， 高于这一温度时会由于ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低； 将１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ在ＣＴＡＢ辅助溶菌酶复性一段时间（如１２ｈ）后再加入到复性体 系，溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中，１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中 的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这～结论。 针对天然乳胶（ＮＲＬ）ＩｔｉｌＪ品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题，考察了海 藻酸钠、透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化海藻
酸钠（ＯＳＡ）、氧化透明 质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（ＯＣＭＣ）对天然胶乳中的蛋白质的固定作 用，对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果，分析了加入氧化多糖后蛋 白质在乳胶膜中的分布情况，讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含 量对乳胶膜的力学性能、热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示，三种氧 化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用；以ＯＳＡ为研究对象表明，乳 胶膜中ＯＳＡ含量越多，乳胶膜中水溶性蛋白质（ＷＳＰ）析出率越低，当ＯＳＡ占干 乳胶的１．６７ ｗｔ％时，乳胶膜ＷＳＰ的溶出率即趋近于０；ＯＳＡ中醛基含量越多，ＷＳＰ 溶出率越低，当ＯＳＡ醛基含量为４．８ ｍｍｏｌ／ｇ时，仅用０．３３ ｗｔ％（以固含量计）的 ＯＳＡｔｉＰ可使乳胶膜中形孓晰出率低于５０｝ｌ眈。未加ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后的质量损失率为５叭％左右，之后质量不再发生明显改变；而含有ＯＳＡ的乳胶膜在 土埋２５天后质量继续下降，其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率， 且ＯＳＡ用量越大，乳胶膜的质量损失率越大。同时，氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。 关键词：ｐ一环糊精，聚（Ｎ一异丙基丙烯酰胺），溶菌酶，复性，天然胶乳，多 糖衍生物，蛋白质固定，降解
第一章 温敏ｐ．环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究 １．１引言
由于环糊精分子中含有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入其分子空腔形 成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，常常需要加入环糊精 以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【１?３１。Ｋａｎｌｐｐｉａｈ等人【４１发现，向 盐酸胍变性的碳酸脱水酶（ＣＡＢ）复性稀释液中加入适量ｐ一环糊精（Ｄ．ＣＤ）可使其复 性率超过９０％。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏 水性位点发生了相互作用。 聚烈．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）是一种具有温度敏感性的聚合物，在一定温 度下能发生亲水／疏水（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｅ—ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）ｎ－Ｉ逆转变，在水溶液中表现为一 种可逆的溶解／沉淀行为【５１（在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀／收缩行为【６】）。发生这一转变时的温度即为
相转变温度（Ｌｏｗｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ＬＣＳＴ），而ＰＮＩＰＡ水溶液的ＬＣＳＴ在３２℃附近〔７，８Ｊ。ＰＮＩＰＡ曾被用于蛋白质的复性 研究【９－１¨。如Ｌｉｎ等人【１０ｌ将ＰＮＩＰＡ用于辅助ｐ．１ａｃｔａｍａｓｅ的复性，发现其复性效率比ＰＥＧ更高，使用ＰＮＩＰＡ可使经盐酸胍变性的１３一ｌａｃｔａｍａｓｅ的活性率提高４ｌ％，而 ＰＥＧ只能提高２６％。Ｌｕ等人【１１】曾采用ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ，圆二色谱和荧光光谱等方法研 究了ＰＮＩＰＡ对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性作用是因 为ＰＮＩＰＡ增强了蛋白质的二级结构并抑制了溶菌酶的聚集作用，从而促进蛋白质的复性。 将６．ＣＤ与ＰＮＩＰＡ耦联，制备具有温度敏感的１３一环糊精衍生物（１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ） 主要被用于药物释放系统的研究?协１６１。虽然Ｌｕ等人四曾将该体系用于溶菌酶的复性，但偶联产物中的Ｂ．ＣＤ结构单元主要用于剥离表面活性剂ＣＴＡＢ，而未考察其对溶菌酶的复性作用。结合Ｋａｒｕｐｐｉａｈ等人１４】的研究，我们认为，ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ 用于辅助蛋白质复性时，其分子中ＰＮＩＰＡ链段及环糊精的疏水性空腔应当可以同 时促进溶菌酶的复性，即具有协同辅助蛋白质复性的作用。 为验证这一假设，本研究采用端基耦联的方法，合成了具有温度敏感的Ｂ—ＣＤ 衍生物（１３．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ），比较研究了ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物：氨基一ｐ一环糊 精（ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ）、带末端羧基的聚（Ｎ一异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ）对尿 素变性溶菌酶的复性效果，并采用荧光光谱分析了ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性 机理；同时探讨Ｔ?ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ与十二烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）结合使用时对溶 菌酶复性的协同作用。
１．２实验部分 １．２．１原料与试剂
Ｎ．异丙基丙烯酰胺（ＮＩＰＡ，Ａｃｒｏｓ公司，美国），正己烷重结晶；巯基丙酸 （ＭＰＡ，Ａｃｒｏｓ公司，美国）；１．（３一二甲氨基丙基）一３．乙基．碳二亚胺（ＥＤＣ，Ａｃｒｏｓ 公司，美国）；偶氮二异丁腈（ＡＩＢＮ，上海试四赫维化工有限公司），甲醇重结晶纯 化；ｐ一环糊精（上海伯奥生物科
技有限公司），使用前于１１０℃干燥１２ ｈ；对甲苯磺 酰氯（中国医药集团上海化学试剂公司）；溶菌酶、盐酸胍、二硫苏糖醇（Ｄ订）、还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）、氧化型谷胱甘肽（ＧＳＳＨ）和微球菌均购自美国Ｓｉｇｍａ公 司。十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）购自日本Ｗａｋｏ公司；其余试剂均为分析纯。透析袋（Ｍｗ ３５００，华美生物工程公司上海分公司）。样品溶液用去离子水配制。
１．２．２ ＥＤＡ－ｐ．ＣＤ的制备与表征
ｇ ＩＢ－ＣＤ和１．３９ 参，照Ｎｏｚａｋｉ等人ｆ１３１的方法，在１００ｎ儿无水吡啶中依次加入１０ 对甲苯磺酰氯，于２５℃、搅拌条件下反应２ｈ。在４０℃减压蒸馏出吡啶后，向反 应混合物中加入２０ｍＬ水。过滤，水洗３次除去吡啶，真空干燥得到白色粉末。将２ ｇ上述制备的白色粉末与２０ ｍＬ无水乙二胺在４０℃反应４８ ｈ。在减压 蒸馏出无水二乙胺后，向油状物中加入３０ ｍＬ丙酮。过滤，将沉淀溶于２０ ｍＬ 甲醇．水溶液（体积比３：１）。往所得溶液中加入２００ ｍＬ丙酮，得白色沉淀。过 滤，真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。
１。２．３ ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ的制备与表征ｇ 参照Ｎｏｚａｋｉ等人ｐ３〕的方法，将５ ＮＩＰＡ和２３．４ ｍｇ链转移剂ＭＰＡ溶解于 ２ ６０ ｍＬ甲醇中。通氮气２０ ｍｉｎ，加入５０．７ ｍｇ引发剂ＡＩＢＮ，在氮气保护下，于 ７０”Ｃ、搅拌条件下反应７ ｈ。减压蒸馏出大部分甲醇，用丙酮／正己烷体系纯化两 次。将所得沉淀过滤并真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。
１．２．４ ｐＣＤ．ＰＮＩＰＡ的制备与表征ｇ 参照Ｎｏｚａｋｉ等人〔１３１的方法，将２ ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ溶解于２０ ｍＬ蒸馏水中，ｇ 加入４３５ ｍｇ ＥＤＣ。调整溶液ｐＨ值为５．５，加入２ ＥＤＡ－Ｄ—ＣＤ，在室温下搅拌 反应２４ ｈ。所得溶液装入到透析袋（Ｍｗ３５００），用水透析２４ ｈ以除去未反应的１３－ＣＤ 与小分子物质。溶液冷冻干燥得到一种淡黄色粉末。将所得的淡黄色粉末分散在 ＴＨＦ中，用ＴＨＦ－ｎ．ｈｅｘａｎｅ（体积比２：１）沉淀，真空干燥。所得产品为黄色粉末。 用核磁和红外光
谱进行表征。
１．２．５溶菌酶的变性 参照Ｄｅｓａｉ等人【１８】的方法，将一定量的溶菌酶分别溶于盐酸胍变性缓冲液和 尿素变性缓冲液（盐酸胍变性缓冲液：３０ｍ０１．Ｌ－１Ｏ．１ ｍｍｏｌ?Ｌ．１ ＤＴＴ、６ ｍｏｌ?Ｌ．１盐酸胍和０．１ Ｔｒｉｓ一硫酸，ｐＨ值８．５；尿素变性缓冲液：３０ ｍｍ０１．Ｌ－１ ＤＴＴ、８ ｍｏｌ?Ｌ－１尿素、 ｍｏｌ?Ｌ－１”Ｉｒｉｓ—ＨＣＩ，ｐＨ值８．６和１ｍｍｏｌ?Ｌ－１ ＥＤＴＡ）置于３７。Ｃ下反应３ｈ，使溶菌 酶彻底变性和还原，得到浓度为３０ ｍｇ?ｍｌ。的变性溶菌酶溶液，放置于４。Ｃ冰箱 中保存备用。
１．２．６溶菌酶复性将１ ００ ｌｘＬ浓度为１ ２ ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＡ一１３．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或ＩＢ－ＣＤ－ＰＮＩＰＡ 溶液分别缓慢加入到１００ ＩｘＬ浓度为３０ ｍｇ／ｍＬ的溶菌酶中，复性３０ ｍｉｎ后，加 入复性缓冲液至溶液总体积为３ ｍＬ，在室温下（３ ｌ℃）继续复性２４ ｈ。不含任 何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。复性缓冲液为ｐＨ为８．２的Ｏ．１ＥＤＴＡ、ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ ｍｏｌ／Ｌ晡ｓ．ＨＣＩ溶液，该溶液还含有ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ ＧＳＳＧ和１０ ｍｍｏＩ．Ｌ－１ＧＳＨ。
１．２．７ ｐ－ＣＯ—ＰＮＩＰＡ浓度对溶菌酶复性的影响ｐＬ、１００ 将１０ ｌａＬ和１ ｍＬ浓度为１２ ｍｇ／ｍＬ ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液分别缓慢加入 到１００ ｇＬ浓度为３０ ｍｇ／ｍＬ的盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶溶液中。复性 ３ ３０ ２４ ｍｉｎ后，加入复性缓冲液至溶液总体积为３ ｍＬ，在室温下（３１℃）继续复性 ｈ。不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。
１．２．８复性温度对溶菌酶复性的影响 将１００｝ｌＬ浓度为１２ ｍｇ／ｍＬ雕ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液缓慢加入到１００ ｐＬ浓度为３０ ｍｇ／ｍＬ的尿素变性溶菌酶溶液中，然后将溶液在某一个特定温度条件下（２５℃、 ２８”Ｃ、３０”Ｃ、３２”Ｃ、３３。Ｃ或３４”Ｃ）复性３０ ｍｉｎ后，加入复性缓冲液溶液总体积为３ ｍＬ，继续复性２４ｈ。
１．２．９表面活性剂ＣＴＡＢ对溶菌酶复性的影响将１００ ＩｌＬ浓度