为１２ ｒａｇ／ｍＥ的１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液和１００ｌｘＬ Ｏ．０２ ｍｌＶｌ ＣＴＡＢ 溶液按照以下方式加入到１００ ｌｘＬ浓度为３０ ｒａｇ／ｍＥ的尿素变性溶菌酶溶液中：ａ） 仅加入ＣＴＡＢ溶液；ｂ）〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液和ＣＴＡＢ溶液同时加入；ｃ）在加入ＣＴＡＢ溶液１２ ｈ后再加入ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ溶液。将这些溶液在室温（３１℃）下放 置２４ ｈ。以不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。
１．２．１０相转变温度（ＬＣＳＴ）的测定 通过测定浓度为ｌ ｒａｇ／ｍＥ的ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和〔Ｂ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液在５００ ｎｎｌ的 吸光度值确定聚合物的相转变曲线。所用仪器为ＴＵ一１８００ＳＰＣ ＵＶ分光光度计（中 国，北京）。吸光度一浓度曲线拐点的横坐标值即为该聚合物的ＬＣＳＴ平均值。
１．２．１１ 溶菌酶活性的测定 依据Ｊｏｌｌｅｙｔｌ９１提出的以微球菌为底物的方法测定溶菌酶的活性。将微球菌溶于ｐＨ为６．２４的０．１ Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４一ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液中，使该溶液在４５０ ｎｌｎ的吸光度为 １．３０。将０．５ ｍＬ溶菌酶溶液加入到２．５ ｍＬ底物溶液中，于２５℃混合３０ ｓ，每隔５ｓ 测定一次所得悬浮液在４５０ ｎｎｌ的吸光度，共测定１３次。所得吸光度与时间的关系 曲线为一直线。将该直线的斜率与同浓度的未变性溶菌酶溶液所得的直线进行对 比，即可得到溶菌酶的复性率，结果用百分比表示【２０１。
１．２．１２ 荧光光谱分析用Ｏ．０５ Ｍ ＰＢＳ缓冲液配制浓度分别为５０ ｒａｇ／ｍＥ、２０ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｒａｇ／ｍＥ、５ ｍｇ／ｍＬ汞〕１ ｍｇ／ｍＬＩ拘ＥＤＡ．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨＪ阿Ｉ〔Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液，用黼表示。４ 另用０．０５Ｍ ＰＢＳ缓冲液配制浓度为Ｏ．０５｜ｌ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液，用拗表示。将５００ Ｌ黼和２ ｍＬ黼混合，所得溶液用ＲＦ一５３０１ＰＣ荧光分光计（日本）扫描。 设置激发和发射间距为１０ ｎｌｌｌ。在２８０ ａｍ激发蛋白质溶液，记录３００”－－－?４５０ｎｍ范围 内溶液的发射光谱。
１．３结果与讨论
１．３．１ 核磁和红外表征 （ｔ｝－ＣＤ） ｆｒｏｓｙｌ－Ｂ－ＣＤ） （ＥＤＡ—Ｉ？，－ＣＤ） （Ｉ孓－ＣＤ－ＰＮＩＰＡ） 图１．１ １３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的合成路线 一。一Ⅻ１３６０ 、．铺。厂、』一Ｉｒ人让小１０５０ｃ ｖ０８‰ ３５００ ３０００ ２５００ 懈洲黜７２２０００ １５００ １０００ ５００ ４０００ 图１．２ ＥＤＡ．１３．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和Ｄ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的红外谱图 ａＩ ｊ ｂ —，Ｕ． …６ ＩＯ＿Ｏ咚Ｊ”－ＮＨｌ入 二上几 Ｌ…ｂ＼．．Ｌ叫汹、Ｊ－ 八 ４ ３ ２ 一．—√、．，／、、～，＼一 Ｊ＼ ｃ，‖晦、人人≥；人１６ ５ ４ ３ ２ ０ ｐｐｍ（ｆ１）图１．３ ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ和１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的核磁谱图 〔Ｂ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的合成路线如图１．１所示。首先Ｂ－ＣＤ糖坏上的羟基氢被磺酰 基取代，然后磺酰基被乙二胺的氨基取代生成氨基化的环糊精，最后在水溶液中， 氨基环糊精与带末端羧基的ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ经ＥＤＣ催化缩水偶合得到 ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ。ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ、带末端羧基的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ以及最终产物１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的红外光谱图分别如图１．２ａ、图１．２ｂ和图１．２ｃ所示。在ＩＢ－ＣＤ—ＰＮ口Ａ 红外谱图（图１．２ｃ）中，～１０４３锄－１（ｓ，Ｃ．ＯＨ）峰对应为１３－ＣＤ上的羟基伸缩振动峰。～１６３７ ＣＩＩｌ－１和～１５４４锄＿１峰对应为酰胺Ｉ和酰胺ＩＩ的吸收（来自ＰＮＩＰＡ结 构单元）。～３３００伽．１～３５００ ｃｍ＿是一个很强很宽的谱带，对应为Ｎ．Ｈ、ｏ．Ｈ（包括醇羟基与羧羟基）的总吸收。ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、ＥＤＡ一８一ＣＤ以及ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的核磁谱图分别如图１．３ａ、图 １．３ｂ和图１．３ｃ所示。在这三种结构中，各氢的化学位移分别为，科．９（７Ｈ，Ｃ（１Ｗ）３．３（５Ｈ，一ＣＨ２ＣＯ—ＥＤＡ－Ｂ—ＣＤ），２．５（Ｉ ＯＨ，?ＣＨ２Ｓ－），１．９６（３７Ｈ，ＣＨＣＯＮＨ一），１．４３（７０Ｈ， 一ＣＨＣＨ２ＣＨ一）?１．０３（７Ｈ，．ＣＨ３）。由图３ｃ看出，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ既存在ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ 的特征峰，也存在ＥＤＡ—Ｂ—ＣＤ的特征峰。 ６ 通过ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ以及ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ红外及核磁谱图的对比， 证明ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的末端羧基已成功与ＥＤＡ—ｐ．ｃＤ的氨基发生酰胺化反应。
１．３．２ ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ和弘ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的温敏性质 浓度为０．１ ｍｇ／ｍＬ的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ水溶液在５００ ｎｍ处的吸光 度随温度的变化如图１．４所示。随着溶液温度的升高，ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和 ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ水溶液的吸光度分别在溶液温度在３２．４℃或３３．６”０时急剧升高。根据 前述对ＬＣＳＴ的定义，此温度即对应为ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ。 ＰＮＩＰＡ在其ＬＣＳＴ附近会发生可逆的亲水／疏水转变，当溶液温度低于ＬＣＳＴ 时ＰＮＩＰＡ表现为亲水性，ＰＮＩＰＡ依靠氢键作用与水互溶：当溶液温度高于ＬＣＳＴ 时，ＰＮＩＰＡ由亲水性转为疏水性，与水脱离并发生聚集，从而导致溶液的吸光度 增大。图１．４ｃ显示，ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ的ＬＣＳＴ为３２．４”Ｃ，与文献报道接近【７?８】。ＰＮＩＰＡ 与亲水性基团结合以后会导致其ＬＣＳＴ升耐２１１，而氨基改性Ｂ．ＣＤ表现为亲水性，所以Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ略高于ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ，为３３．６”Ｃ。 ３．０ ２．５ ∞ Ｕ Ｃ ２．０ 至１．５ Ｌｏ 兰１．０《０．５ Ｏ．０ ２６ ２８ ３０ ３２ ３４ ３６ ３８ ４０ ４２ ４４ ４６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉ。Ｃ 图１．４ ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变曲线７
１．３．３肛ＣＤ－－ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果
将不同浓度的Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分别用于盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶的 复性，其活性收率如表１．１所示。从表１．１看出，随着复性体系中Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ浓度 的增大，盐酸胍变性溶菌酶的活性率逐渐减小，从５５．８％（直接稀释法复性）减 ／Ｊ，至ｌＪ３４．４％（ｔ３．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ浓度为０．８ ｍｇ／ｍＬ）；而尿素变性溶菌酶复性的活性率 则逐渐增大，从５５．８％（直接稀释法复性）增至８３．７％（１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ浓度为０．４ ｍｇ／ｍＬ）。即在盐酸胍变性溶菌酶的复性体系中，〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ不仅不能促进溶 菌酶的复性，反而对其复性有抑制作用。而与此相反的是，对于尿素变性溶菌酶 的复性体系，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性具有较好的促进作用。导致这一实验 现象的原因有待进一步研究，
在后续实验中，为了验证Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的 复性作用，我们以尿素变性溶菌酶作为研究对象。 表１．１不同浓度的ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对不同变性体系变性溶菌酶的复性
１．３．４ ＥＤＡ．争ＣＤ、ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ或ＩＶＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果 在３ｌ℃，变性溶菌酶（尿素变性溶菌酶，以下同）最终浓度为ｌ ｍｇ／ｍＬ时，将０．４ ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＡ．Ｂ—ＣＤ、ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ和〔ｊ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液分别用于辅助 溶菌酶复性，其复性效果如图１．５所示。使用ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ辅助溶菌酶复性时，溶 菌酶的活性率为７１％，使用ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ辅助溶菌酶复性时，其活性率为７２．２％， 而使用１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ辅助溶菌酶复性时，其活性率为８３．７％。三者均高于直接稀 释法复性所得的活性率。这说明ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对 尿素变性溶菌酶的复性均有促进作用，而〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的促进作用最大。 作为一种蛋白质的复性辅助剂，环糊精不仅可以抑制蛋白质的聚集作用，同 时还能有效地促进蛋白质折叠复性至其天然状态以恢复其活性瞄粕１。伸展的或部分折叠的中间体疏水性表面与环糊精疏水性空腔之间的相互作用降低了分子间８ 的疏水作用力，从而有效地消除或抑制了蛋白质的聚集作用ｆ２３Ｊ。而ＰＮＩＰＡ则通 过其疏水性链段与蛋白质复性中间体氨基酸的疏水性侧链之间的疏水作用促进 蛋白质的复性【１０１。显然，在本实验中，〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中环糊精空腔和ＰＮ口Ａ一 乍 旷 引 乍 ｜｜ Ｉ 疏水性链段的同时对溶菌酶的复性起到了辅助作用。即Ｊ３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的 Ｉ匿－ＣＤ疏水性空腔和ＰＮＩＰＡ疏水性链段对溶菌酶的复性具有协同作用。 ／ ／ ／ ／ ／ ｌ“ ／／Ｚ／ ；｝ｚ嚣 ｌｌ 象 器 貉 瑟 簟．鼍？绻 爹 蓉? 誓瞄：§Ｌ。－矗矗。 赞黟一 蘑琵一 ｌ 筑 参 雠。 Ｕ ７罗．／
１．３．５争ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性机理 溶菌酶分子中含有能发出内源荧光的色氨酸及酪氨酸。当蛋白质与物质发生 物理碰撞或化学结合以后，蛋白质的荧光会发生一定的变化，这一规律常被用于 研究蛋白质与物质之间的相互作用机理ｌ硎。 图１．６是在变性溶菌酶溶液中加入一定量的ＥＤＡ—ｐｃＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或 〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ后溶液的荧光光
谱图。由图看出，溶菌酶溶液的荧光光谱曲线的形 状未发生明显变化，但是荧光强度存在一定差异：加入含有Ｂ—ＣＤ结构单元的 ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ和ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ时，随着辅助剂浓度的增加，溶液的荧光强度逐渐降低， 且在辅助剂浓度相同时，加ＡＥＤＡ—Ｂ—ＣＤ后荧光强度降低幅度比Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ降低 幅度更大（图１．６（ａ，ｃ）；而对于不含１３．ＣＤ结构单元的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ，即使辅助 剂的浓度高达５０ ｍｇ／ｍＬ时溶液荧光强度的变化仍不明显（图１．６（ｂ））。这表明 ９ 对于溶菌酶而言，ＥＤＡ．ＣＤ和ＩＢ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ是良好的焯灭剂，而ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ不具有荧光ｊ卒灭作用。 ９０ ６０ ３０ ０ ９０ ｃ，） Ｃ ３０ ＃０ Ｌ９０ ６０ ３０ Ｏ ３００ ３２０ ３４０ ３６０ ３８０ ４００ ４２０ ４４０ ａ） Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ图１．６不同浓度的ＥＤＡ—ｐ．ＣＤ、ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ加入变性溶菌酶溶液 后的荧光光谱图。ａ?ＥＤＡ．ＩＢ－ＣＤ；ｂ，ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ；ｃ，ｐ—ｃＤ—ＰＮＩＰＡ。ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ， ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的浓度分别为①＝Ｏ；②＝ｌ ｍｇ／ｍＬ；③＝５ ｍｇ／ｍＬ； ④＝ｌ Ｏ ｍｇ／ｍＬ；⑤－２０ ｍｇ／ｍＬ；⑥＝５０ ｍｇ／ｍＬ； 如果溶菌酶被包络在ＥＤＡ．ｐ．ＣＤ或ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ｐ—ＣＤ的疏水性空腔中，那 么由酪氨酸和色氨酸产生的天然荧光就可能被屏蔽，从而导致溶菌酶荧光强度降 低。特别地，当ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ浓度为５０ｍｇ／ｍＬ时，溶菌酶的荧光强度已接近于０，表 明溶菌酶分子基本上都被包络进１３．ＣＤ的疏水性空腔中。相对于相同浓度的 ＥＤＡ．ｐ．ｃＤ而言，由于ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ中ＰＮＩＰＡ链段的空间位阻效应以及相对较低的１０ １３－ＣＤ浓度，〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ可以包络溶菌酶的数量相对少：Ｊ：ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ，所以其荧 光强度的减弱程度略小于ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ。复性体系的荧光光谱法实验证明了ＩＢ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中ｐ．ＣＤ结构单元对溶菌酶分子的包络作用。 １．３．６不同温度时溶菌酶的复性 不同温度下０．４ ｍｇ／ｍＬ的Ｄ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果如图１．７所示。从 图中看出，随着温度的升高，溶菌酶的活性率逐渐增大。当温度达到３２℃时，溶 菌酶的活性率最大。但继续升高温度，溶菌酶的活性率反而降低。结合 〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的