相转变温度（见图１．４），发现溶菌酶的活性率最大时的温度与 ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度接近。这是因为，当温度达到ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的相转变温 度时，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ会由亲水性转变为疏水性而发生聚集，从而导致溶菌酶的活 性率急剧下降。因此，在将ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ用于辅助溶菌酶复性时，复性温度应低于Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ。 ９０ 邑８０勺７０ ６０ ５０ ４Ｏ ３Ｏ ２Ｏ Ｉ 名 ?一 ｈ １ 《 ∞矗州口一ｏｑ。篮 １Ｏ Ｏ 二《ｉ 鬻隧 ～艮 甏簪： 引 ‰妇ｊ，．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃） Ｉｎｃｕｂａｔ ｉｏｎ 图１．７不同温度下Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ辅助溶菌酶复性的复性率（溶菌酶最终浓度为ｌ ｒａｇ／ｍＥ，１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的浓度为Ｏ．４ ｍｇ／ｍＬ）
１．３．７ ｐ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ联合辅助溶菌酶复性 将１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ按三种不同的添加方式：（１）仅加入ＣＴＡＢ； （２）１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ同时加入；（３）加入ＣＴＡＢ，复性１２ｈ后再加入 ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ，继续复性１２ｈ。溶菌酶的复性率如图１．８所示。 从图１．８看出，〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时加入到变性溶菌酶中进行复性时， 溶菌酶的复性率低于单独使用ＣＴＡＢ或Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ，而在ＣＴＡＢ复性１２ｈ后再加 入ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ，溶菌酶的复性率高于单独使用ＣＴＡＢ或ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ。 将１３一ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时用于辅助溶菌酶复性时，ＣＴＡＢ的疏水链段与溶 菌酶分子竞争进入环糊精的疏水空腔，但由于ＣＴＡＢ的疏水链段的疏水性强于溶 菌酶分子，所以ＣＴＡＢ会优先进入环糊精的空腔内内【２１，这一竞争过程一方面导致部分环糊精的空腔被ＣＴＡＢ占据，使可以容纳溶菌酶的环糊精空腔减少；另一 方面也导致溶液中ＣＴＡＢ的浓度大大降低，从而降低ＣＴＡＢ对溶菌酶的复性率。 所以ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时用于溶菌酶复性时，其复性效果较单独使用ＣＴＡＢ 和ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ差。而在使用ＣＴＡＢ复性１２ｈ后，溶菌酶的复性过程已基本上完成， 此时再加入Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ可能使部分未复性的溶菌酶在环糊精的疏水性空腔的疏 水作用下继续复性ｆ４ｌ，从而使最终溶菌酶的复性率高于单独使用ＣＴＡＢ的复性效 果。实验表明，按这种方式（第三种加入方式）对溶菌酶进行复性，
〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ具有协同作用。 墓ｊ４Ｄ 甍 葺 名 莲 图１．８采用不同的添加方式１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ对溶菌酶的复性效果。 Ｍｅｔｈｏｄ（１）：仅加入ＣＴＡＢ；ｍｅｔｈｏｄ（２）：ＣＴＡＢ与ｐ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ同时加入复性液；ｍｅｔｈｏｄ（３）：ＣＴＡＢ复性１２ｈ后再加入ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ１２ 当复性完成以后，利用ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ相变功能，通过升高温度可将ＣＴＡＢ从 溶菌酶分子上剥离出去，从而为溶菌酶的后续纯化带来便利。同时，在 Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ剥离表面活性剂以后（或Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ单独使用），同样可利用其温 敏相变功能儿实现Ｂ，ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的循环使用（图１．９）。 图１．９ ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的循环使用示意图 １．４本章小结 〔ｊ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物ＥＤＡ．Ｄ—ＣＤ和ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ对尿素变性溶菌 酶的复性过程均有促进作用，而Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性过程却 具有抑制作用，不能用于辅助盐酸胍变性溶菌酶的复性。ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的Ｂ．ＣＤ疏水性空腔及ＰＮＩＰＡ链段可以共同促进溶菌酶的复性，具有协同辅助溶菌 酶复性的作用，荧光光谱的研究结果证实了这一结论。Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的浓度对溶 菌酶的复性效果有一定的影响，当溶菌酶的最终浓度为１ ｍｇ／ｍＬ时，０．４ｍｇ／ｍＬ 的Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果最好：而复性温度应当控制在其ＬＣＳＴ以下。 １３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ结合用于辅助溶菌酶的复性时，最好在ＣＴＡＢ作用一段时间 后（约１２ｈ）再加入复性体系，否则会对溶菌酶的复性产生不利影响。由于 ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ具有温敏相变功能，在复性完成以后，可通过升高体系温度实现 ｆｌ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ（或包络了ＣＴＡＢ的１３．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ）从复性体系中分离，为溶菌酶的后续纯化带来便利。并实现ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的循环使用。
１６ 第二章 氧化多糖衍生物用于天然胶乳改性的研究 ２．１引言
天然橡胶乳液州ＲＬ）是一种生物合成的高聚物水基型胶体体系，以聚顺式一 异戊二烯为主体，并有十几种组分的物质。其主要成分为橡胶烃、水、非胶
物质， 其中非胶物质主要由蛋白质、类脂物、丙酮溶物、水溶物、无机盐等组成。天然 胶乳具有优异的工艺操作及物理性能，其湿凝胶强度高、弹性大、蠕变小等，就 其通用性而言，目前尚无其它材料能替代，仍然是医务工作者隔离病毒及感染性 微生物的最好选择。 上世纪以来，由于人们对预防艾滋病、肝炎等病毒感染的意识增强，导致了 乳胶制品特别是手套和避孕套需求量的急剧上升，但很快人们发现使用乳胶制品 会引发一种过敏症，其最先的症状是荨麻疹，表现为皮肤瘙痒、发炎、起疙瘩、 长水泡等症状，严重时会引起过敏性休克、甚至死亡【ｌ】。最初人们认为是乳胶制 品生产过程中加入的助剂，如秋兰姆、琉基苯并噻唑、氨基甲酸盐等引起的过敏 症，后来对乳胶制品的过敏性进行深入的研究，发现天然胶乳本身含有的水溶性 蛋白质（ＷＳＰ）是引起过敏的主要原因【２１。 鲜胶乳中蛋白质的含量占胶乳重的１－２％ｔ３１，其中约２０％被橡胶粒子所吸附， 是构成粒子保护层的重要物质，约２０％存在于胶乳底层的液体中，共余部分则 溶解于乳清。这些蛋白质是决定橡胶粒子胶体稳定性的主要因素【４，５１。为解决乳 胶制品中水溶性蛋白的过敏性问题，目前主要采取的方法是降低乳胶中的水溶性 蛋白的含量，国际上普遍认为，当乳胶手套中水溶性蛋白质质量分数小于０．０００１ 时，对胶乳过敏的人在皮肤刺激试验中几乎不显示过敏反应，但大多数国家要求其质量分数应小于０．０００５ １６１。 降低天然胶乳中水溶性蛋白质比较成熟的方法有：（１）氯化法ｆ７，８ｊ：利用浓 盐酸与次氯酸钠反应释放出的氯气与ＮＲ发生交联和环化反应，在乳胶表面形成１７ 防止蛋白质迁移的阻断层。同时使蛋白质变性而使其难以溶解。氯化法是降低胶乳手套水溶性蛋白质含量的一种非常有效的方法，也是目前工业上普遍采用的办法。但氯化处理产生的氯化废水会对环境造成污染。（２）沥滤法〔９１：有湿凝胶 沥滤和干胶膜沥滤。湿凝胶沥滤是指在干燥前洗涤附着在模具上的湿凝胶，干胶 膜沥滤是指在胶膜干燥和硫化后洗涤附着在模具上的胶膜。（３）多次离心法【ｌｏ】： 由于胶乳中的非橡胶物质绝大多部分分布在乳清相和小胶粒中，通过反复加水稀 释胶乳和离心浓缩可制成非橡胶物质含量极低的胶乳。（４）酶处理法【Ｉｌ－１４１：利用 蛋白酶分解破坏天然胶乳包括胶粒表面保护层中的蛋白质，将分解出来的蛋白质 转变成水溶性物质，再通过离心分离除去或在沥滤中洗掉，从而大大减少天然胶 乳制品中的含
量。（５）辐射硫化法１１５】：使用＾ｒ射线或电子束对离心浓缩胶乳进行 辐射硫化，稀释后再离心可得到蛋白质含量很低的低蛋白质胶乳。 上述方法虽然可以有效降低天然胶乳中的水溶性蛋白质含量，但一方面操作 复杂，生产成本高，且有的方法还会对环境造成污染；另一方面由于降低蛋白质 含量会影响天然胶乳的稳定性、生胶的干燥速率、降低生胶的抗氧化性能，同时 对乳胶制品的力学性能也有一定的不利影响【Ｉ ６Ｊ。因此，通过降低胶乳中水溶性 蛋白质（ＷＳＰ）含量的方法解决乳胶制品皮肤过敏问题并不是一个最好的选择。 本研究首次提出通过固定蛋白质的方法来解决乳胶制品蛋白质过敏问题。即 在天然胶乳中添加可生物降解的、具有良好生物相容性的氧化多糖（本研究选取 了海藻酸钠、透明质酸和羧甲基纤维素三种多糖），利用氧化多糖分子上的醛基 与蛋白质分子上的氨基的交联，增大蛋白质的分子量，使蛋白质失去水溶性，从 而将蛋白质固定在乳胶膜内。具体的实验内容包括：氧化海藻酸钠、氧化透明质酸和氧化羧甲基纤维素的制备和表征；三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果比 较；氧化多糖对乳胶中蛋白质分布的影响；添加氧化多糖后，乳胶膜的热重、力 学性能及生物降解性能的研究等。其中，水溶性蛋白质的析出实验通过改进的 Ｌｏｗｅｒｙ方法进行表征；乳胶膜蛋白质的分布情况通过考马斯亮蓝染色法进行评 价；生物降解性能通过室内土埋法进行考察。 １８
２．２实验部分 ２．２．１原料与试剂
高氨离心浓缩天然胶乳（Ｇｏｌｄ Ｔｈａｉ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂａｎｇｋｏｋ，Ｔｈａｉｌａｎｄ），其 部分指标见表２．１。海藻酸钠（ＳＡ，ＡＲ．，天津大茂化学试剂厂），福林酚试剂（ＢＲ， 北京鼎国生物技术有限责任公司），脱氧胆酸钠（ＤＯＣ，Ｂ心上海伯奥生物技术 有限公司），三氯乙酸（ＴＣＡ，ＡＫ天津福晨化学试剂厂），磷钨酸（ＰＴＡ，幔国药集团化学试剂有限公司），考马斯亮蓝（Ｒ ２５０，ＢＲ，上海伯奥生物技术有限公 司），盐酸羟胺（ＡＲ天津天新精细化工研发中心），其他试剂均为分析纯，水 为去离子水。 表２．１高氨浓缩天然胶乳的部分指标（厂家提供）
２．２．２氧化多糖的制备及表征
按照Ｇｏｍｅｚ〔１７】所报道的方法制备氧化海藻酸钠（ｏＳＡ）。将海藻酸钠（１０．００曲溶于６００ ｍＬ蒸馏水中，然后在搅拌下加入１００ ｍＬ高碘酸钠，用蒸馏水将溶液 稀释至总体积１ Ｌ。高碘酸钠的加入比例分别为３，５，１０ ｍ０１％。避光反应２４ ｈ后，１９ 加入３．５ ｍＬ ７，－－醇，继续搅拌Ｏ．５ ｈ终止反应。加入３ ｇ氯化钠和ｌ Ｌ乙醇使海 藻酸钠氧化产物沉淀出来。将所得沉淀重新溶于２００ ｍＬ去离子水，用去离子水 透析４８ ｈ以减少最终产品中的ＮａＣｌ含量和高碘酸钠含量。产物冷冻干燥得到一 种白色产品。用ＦＴ－ＩＲ进行表征。 参照上述方法制备和表征氧化透明质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（ＯＣＭＣ）。
２．２．３醛基含量的测定 在多糖的氧化过程中，糖环单元中的Ｃ＿２和ｃ＿３位置的羟基易转变为羰基。 生成的醛基可与盐酸羟胺发生希夫碱反应转变为含氮衍生物（肟）。通过与ＮａＯＨ 溶液的酸碱中和反应可测定在希夫碱反应过程中生成的ＨＣＩ〔１８，１９〕，并通过如下关 系计算醛基含量。相关的反应式（以海藻酸钠为例）和计算公式如下：Ａｌｇｉｎａｔ争－（ＣＨＯ）ｎ＋ｎ Ｈ２Ｎ－一ＯＨ?ＨＣＩ＝Ａｌｇｉｎａｔｅ－－（ＣＨ＝Ｎ－－ＯＨ）ｎ＋ｎｎ Ｈ２０＋ ＨＣｌ ＨＣＩ＋ＮａＯＨ＝ＮａＣｌ＋Ｈ２０ （１） （２） 【伽Ｄ】（肌。ｌ／ｇ）：—０．１ｘ１０—－３Ｗ ｘＶ （３） 其中，【ＣＨＯ〕为待分析的ＯＳＡ中醛基含量，ｍｏｌ／ｇ；ｙ为滴定ＨＣＩ时所消耗的Ｏ．１ ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液的体积，单位ｍＬ；Ｗ为待分析的ＯＳＡ的质量，单位ｇ。用ＡＶＡＴＡＲ一３６０ＦＩ—ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｎｉｃｏｌｅｔ／Ｎｅｘｕｓ ６７０，ＵＳＡ），采用ＫＢｒ压片法ｇｉｎ～。 扫描室温下ＯＳＡ的红外光谱。扫描范围为４０００－４００ ｃｎｌ～，间距为２
２．２．４乳胶膜的制备
将高氨离心浓缩天然胶乳（５０９）与一定量的氧化多糖氨水溶液混合，然后将 混合物加入到直径为１５ ｔｉｎ的培养皿中，在室温下水平放置ｌ天，待胶乳凝固以后于５０”Ｃ干燥４８ ｈ成膜。乳胶膜中氧化多糖含量分别为０．０３３％，０．１６７％，０．３３％ 和１．６７％。 由天然胶乳（５００）与２５ ｗｔ％氨水溶液（１０９）形成的不含氧化多糖的乳胶膜 为空白样。