生物技术综合试验
目的：主要是通过本课程的学习，使学生受到严格的基因工程和分子生物学等技术实验技
能的训练，熟悉现代生物技术仪器的基本操作使用和应用范围，加深对生物技术系列相关课程基本理论、基本技术原理的理解认识。
实验一、质粒DNA的小量提取 实验二、双酶切反应
实验三、PET28-a质粒载体的胶回收 实验四、引物设计
实验五、目的片段的PCR扩增 实验六、PCR产物的双酶切反应 实验七、PCR产物的胶回收
实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反应 实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备 实验十、重组质粒转化感受态细胞的实验 实验十一、菌落PCR反应
实验十二、IPTG诱导OMP31和BLS融合基因的表达 实验十三、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验一、质粒DNA的小量提取
一、目的要求
1、掌握用试剂盒提取质粒DNA的技术 2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法 二、基本原理
在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、仪器、材料和试剂
1.仪器：微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计
2.材料：含有质粒的大肠杆菌DH5a 3.试剂及溶液：LB培养基、葡萄糖 质粒小提试剂盒 操作步骤
1．质粒DNA的提取
1）培养细菌：将带有质粒的单菌落，接种到LB液体培养基中，37oC，200r/min,过夜震荡培养；
2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
3）取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干；
4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1（确保已加入RNaseA），用枪头混匀；
5）向离心管中加入250μl溶液P2，温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 6）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。 7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）尽量不要吸出沉淀。12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附
柱CP3放入收集管中。
8）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(加入无水乙醇)，12000rmp离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 9）重复步骤8。
10）将吸附柱CP3放入收集管中，，12000rmp离心2分钟，目的是将吸附柱中的残留的漂洗液去除。
11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，温室放置2分钟，12000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。
2．用分光光度计测定质粒DNA的浓度 五、问题讨论
(1)提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到质粒DNA。
(2)利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在260nm和280nm波长下均有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260/OD280是固定的，对DNA样品而言其值大约为1.8－2.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。 六、试验结果
计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度和纯度。
实验二、双酶切反应
一、实验目的
1.掌握双酶切反应的基本原理
2.掌握双酶切反应获得质粒载体的基本方法 二、实验原理
DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了
广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 三、实验材料及试剂
实验材料：
实验一获得的PET28a质粒载体 实验试剂：
EcoR I 、Xho I、10x Hbuffer、灭菌水、冰、37℃水浴
四、双酶切反应体系（20μL） 2μL 1μL H buffer（10x） EcoR I Xho I DNA ddH2O Total 1μL 1μL 4μL 12μL 20μL 0.5μL 0.5μL 5μL 3μL 10μL 五、实验步骤 1) 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪按照体积由大到小的顺序加入上述溶液,再加入重蒸水使总体积为18μl。
2) 将管内溶液混匀后加入2μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 3) 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
注：将加好的反应体系放入37℃恒温水浴锅中反应。如果是载体，则反映时间为5~6h，如果是DNA 则反应时间是1~2h。 附： （A） （B） （C） BamH I 1xK Hind Ⅲ EcoR I 1xm Hind Ⅲ EcoR I BamH I 1xK BamH I Xho I 1xK Xho I 1xm Hind Ⅲ
实验三、PET28-a质粒载体的胶回收 一、实验目的 1.掌握琼脂糖凝胶的制备方法 2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法 3.掌握DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用 二、实验原理 根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基当中，在紫外激发下，发出荧光，即可确定DNA条带在凝胶中的位置而且灵敏度很高，少知1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。 不同浓度的琼脂糖凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量（%） 线状DNA分子的有效分离范围（Kb） 0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7.0 1.2 0.4~6.0 1.5 0.2~3.0 2.0 0.1~2.0 琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶试剂盒回收酶切产物。试剂盒中有一个特制的Column，将硅胶填制到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高PH的条件下DNA可以再次被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。 三、主要实验仪器和试剂 主要仪器： 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。 主要实验试剂： 1、50×TAE （2 M Tris，1M 醋酸，50 mM EDTA（pH8.0）） 2、10×上样缓冲液（loading buffer） 3、分子量标准 DNA Marker 4、琼脂糖
5、EB （溴化乙锭）（黑暗保存）
6、DNA回收纯化试剂盒（AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒） 四、实验步骤 琼脂糖凝胶的制备：