3.将管置于沸水活99℃加热5min，使细胞裂解，DNase变性； 4.12000/min离心，除去细胞残片；
5.取10μL上清液，加入0.5μL空管中准备PCR，用之前至于冰上； 6.菌落PCR反应体系（25μL） 10Xbuffer 0.25μL d NTP 0.5μL P1 0.5μL P2 0.5μL TaqE 0.25μL Mgcl2 2μL 模板 6μL ddH2O 12.75μL 7.PCR循环（循环30次） 4min 94℃ 1 min 94℃ 1 min 55℃ 2 min 72℃ 6 min 72℃ 注：加样体系： 10Xbuffer 1.0μL D NTP 0.24μL P1 0.2μL P2 0.2μL TaqE 0.08μL 模板 2μL ddH2O 6.28μL Total 10μL
反应体系（循环29次） 94℃ 94℃ 54℃ 72℃ 72℃ 4℃
一、实验目的
1.掌握原核表达的基本方法
4min 40s 50s 1min30s 8min 1h 实验十二、IPTG诱导PMP31和BLS基因的表达
2.掌握IPTG诱导蛋白表达的基本方法 二、实验原理
在各种表达系统中，最早被用来研究的是原核表达系统，这也是目前掌握
最为成熟的表达系统。这项技术的主要方法是，将已经克隆入目的基因DNA片段的载体（一般是质粒）转化细菌（主要是大肠杆菌），通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于在短时间内能够获得基因表达产物，而且所需成本比较低廉。
本实验所用到的原核表达系统为诱导表达系统。具体是将已经克隆入目的基因DNA片段（Omp31和Bls基因）的载体（PET28a质粒，含有卡那霉素抗性）转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE）3,然后用诱导物IPTG（异丙基-β-D-巯基半乳糖甘）诱导目的蛋白的表达。
其中，大肠杆菌表达菌株BL21（DE）3的基因组DNA当中，已经整合了病毒基因片段LacUV5强启动子及其下游紧邻的T7 RNA聚合酶基因。当在大肠杆菌BL21（DE）3的培养体系中加入诱导物IPTG（一种非消化性乳糖类似物）后，由于IPTG不能被消化，但却能够和LacUV5强启动子产生持久而强烈的作用，从而使得其下游的T7 RNA聚合酶基因得以持久大量的表达，产生大量的T7 RNA聚合酶。而大量的T7 RNA聚合酶和PET28a质粒上的T7启动子充分结合，从而使位于其起始位点下游多克隆位点上的Omp31和Bls基因得以大量表达，使细胞产生大量的目的蛋白。
三、实验步骤
（1）从筛选平板上挑取阳性克隆子，接种到加有卡那霉素的3ml LB液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养；取2900ul培养液做诱前样品。
（2）余下100ul培养液接种至3ml LB液体培养基（含卡那霉素）中，再加0.1M IPTG 30ul，37℃，300r/min诱导4小时，测OD值为0.5~0.9之间时停止培养；
（3）取诱前和诱后各1ml培养液，置于离心管中6000r/min，离心6min，弃上清，收集菌体；
（4）加200ul水溶菌体再加入100ulMix煮沸5min，-20℃保存备用。
四、思考题
诱导剂IPTG的浓度如何确定？浓度大小对实验的影响如何？
实验十三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 一、目的要求
（1）学习电泳原理和技术
（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术 二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性
人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能： Acr：丙烯酰胺
Bis：甲叉双丙烯酰胺
AP：过硫酸铵——化学催化剂
TEMED：四甲基乙二胺——加速剂
SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。 三、实验材料 （一）试剂
1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1） 称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。用时可做10倍稀释。 5、10% 过硫酸铵（AP）
6、10%SDS（十二烷基磺酸钠） 称取SDS 10g，加蒸馏水100ml使其溶解。
7、四甲基乙二胺（TEMED）
8、上样缓冲液 取1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。
9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝R250染色液：浓度为2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸馏水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。
10、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。 11、样品：实验得到的表达产物。
12、蛋白质分子量标志物 市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。
（二）仪器：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床。 四、实验方法
（一）准备垂直电泳槽、电泳仪。
（二）凝胶制备
按下表分别配制分离胶和浓缩胶 ddH2O 30%混合液 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl 10%SDS 10%Ap TEMED 分离胶(12% 5ml) 1.6ml 2.0ml 1.3ml — 50μL 50μL 4μL 浓缩胶(5% 2ml) 1.4ml 0.33ml — 0.25ml 20μL 20μL 4μL 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶 （三）灌胶
1、先将胶管（5х90mm）封好底，将配制好的分离胶液灌注入胶管内，约70mm高度（掌握分离胶的高度），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm）。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。
2、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶管内（约15mm），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm），用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。胶凝固好后，倒掉覆盖在胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水，准备加样。 （四）样品预处理和加样
1、取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。 2、将胶管封底去掉，放入圆盘电泳槽中，套紧，不能有空的孔，将Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入圆盘电泳上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶管口，然后用微量加样器（或注射器）将样品10μl加到胶管胶面内。
（五）电泳 上槽接负极，下槽接正极，先调电压为120v/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压增加到80v/分离胶胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时间约1.0~1.5h。
（六）考马斯亮蓝染色
电泳结束后，取出电泳胶管，用长注射器针剥胶，一边注水一边推胶，直至胶出。将胶移至大培养皿中，精确量取并记录凝胶长度和指示染料的迁移距离（分离胶上缘到染料条带中心距离），然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用脱色液脱色1~2天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。
（七）校正曲线的数据处理和分子量测定 精确量取并记录染色后凝胶长度、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移距离（分离胶上缘到各蛋白质区带中心）。按下式计算各蛋白质的相对迁移率（Rm值）。 Rm =
在半对数纸上，以各标志蛋白质的Rm值为横坐标（普通尺度），相应的分子量为纵坐标（对数尺刻度）作图，即得分子量校正曲线。根据各待测蛋白质的Rm值，查此校正曲线，可求各待测蛋白质的相对分子量。 五、注意事项 1．制胶过程中用正丁醇封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
2．本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大，否则会出现过载现象。尤其是考马斯亮蓝R250染色，在蛋白质浓度过高时，染料与蛋白质的氨基(－NH)形成的静电键不稳定，其结合不符合Beer定律，使蛋白质量不准确。
3．Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。