1、将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平；
2、用1×TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其溶解； 3、待琼脂糖溶液冷却至60°C左右时，缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm；
4、插入梳子，静待琼脂糖凝固；
5、将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液，没过胶约5mm； 6、小心拔掉梳子，用20 ul移液器吸取DNA溶液（20 ul DNA 加 2～3ul 10×loading buffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加6 ul DNA Maker；
7、接通电源，（注意电源的正负极！）电泳至条带前缘到达胶的2/3左右，约20～30分钟；
8、电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，放入EB染色液中，染色6-8min，然后置于紫外灯下观察。 酶切产物凝胶回收：
1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。（100mg凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！） 2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A（600 ul），混合均匀后，于65°C 加热，直至凝胶完全熔化。
3、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B（300 ul）,混合均匀，当分离的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。
4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml 离心管中），12000r/min离心1 min，弃滤液。
5、将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1， 12000r/min离心30 sec，弃滤液。
6、将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12000r/min离心30 sec，弃滤液。重复一次。
7、将制备管置回2 ml离心管中，12000r/min离心1 min。彻底去除残余的液体。 8、将制备管置于1.5 ml离心管中，在制备膜中央，加25～30 ul 65°C Eluent或去离子水，室温静置1 min。12000r/min离心1 min洗脱DNA。 五、思考题：
1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
实验四、引物设计
一、实验目的
掌握引物设计的方法和原理 二、实验步骤
1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物
①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.
③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.
⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二
聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％ 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。
第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。 三、注意事项：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温
度。引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
9.引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在2度之内。 10.密码子的简并，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
实验五、聚合酶链式反应（PCR）
一．实验目的
1．学习并掌握PCR基因扩增的操作方法
2．理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性 二．实验原理
设计出一对寡聚核苷酸引物可与目的DNA分子互补，以至于能被DNA聚合酶相向延伸，那么被该引物结合的摸板区就可通过变性、退火和聚合的循环来大量扩增，这一过程被称为聚合酶链式反应。该技术1985年由Mullis及同事们设计并研究成功，其原理类似于DNA的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧互补的寡聚核苷酸引物经过变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍，该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必须工具。
PCR的工作程序如下：在第一个循环中，目的DNA在加热至95℃，60s左右的条件下分成两条单链；当降温至55℃（约30s）左右时，引物首先与模板杂交复性；退火后温度再升至72℃（60s-90s）以进行聚合反应，聚合反应要消耗反应混合物中的dNTPs，并需要Mg2+。第一次聚合反应中不同的目标分子从引物3’末端开始扩增，不断对目标分子进行拷贝，新合成分子的长度可以各不相同。当温度再次升高到95℃，变性所有新合成分子的第二次循环开始。 每一对PCR引物长度约为18-30个核苷酸，并且成对引物间的G+C含量应相似，以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合。短的寡核苷酸的退火温度可用下列公式计算：Tm=2（A+T）+4（G+C），引物与目的序列的相应链退火，结果
′
可通过向3端加核苷酸相向延伸，较短的片段较易扩增。 三、实验材料及试剂
1. 模板DNA（含有OMP31和BLS基因的PET28a质粒载体） 2．对应目的基因的特异引物 3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶
四、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 2.5 μl dNTP mix （2mM） 2 μl 引物1（10pM） 1 μl 引物2（10pM） 1 μl Taq酶 （2U/μl） 0.5 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 0.5 μl 加ddH2O至 25 μl
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。程序：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30次，最后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 五、PCR反应体系的组成与反应条件的优化
PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。
1．反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。
2．dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
3．Taq DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。 4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。
⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。