⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。
⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。
⑸引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5． 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。
四、注意事项
1．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
2．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 4．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
6．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
实验六、PCR产物的双酶切反应（同实验二） 实验七、PCR产物的胶回收（同实验三）
实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反
应
一、实验目的
掌握酶连反应的条件、原理 二、实验材料及试剂
实验材料：
实验三得到的PET28a质粒载体、实验七得到的目的片段（Omp31和Bls） 实验试剂：
T4DNA ligase 、10xT4Buffer、ATP、灭菌水
三、酶连体系：
10xT4 Buffer 1.0μL 1.0μL 目的DNA片段 1.0μL 载体 T4DNA ligase 0.5μL ddH2O 6.5μL Total 10μL 将加好的反应体系混匀后，放入16℃金属浴中连接3h。
实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备
一 、实验目的
学习氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞 二 、实验原理
人们发现用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R—、M－表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 三． 仪器、材料和试剂
1.仪器和材料: 恒温摇床、电热恒温培养箱、超净台、分光光度计、台式离心机、离心管、大肠杆菌BL21(DE)3 2．试剂:
（1）基本培养基 在三角瓶中，将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。待冷却至55℃在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/L CaCl2，20mL灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过滤除菌）。（4倍盐溶液：6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5gNaCl,1g NH4Cl,加水至250mL并调pH至7.4）。
（2）LB培养基（1L）:将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含卡那霉素的LB培养基，则将15克琼脂加1L LB培养液中高压灭菌，待冷却至55℃,向其中加入1.5mL100mg/ml的卡那霉素。 （3）0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2(含20%甘油)两者均调pH值至7.2并
高压灭菌备用。 四．操作步骤 氯化钙法
a) 用划线培养法将大肠杆菌接种于基本培养基平皿上，于37℃倒置培养
1d-2d.
b) 将单个菌落接种于10mL LB培养液的试管中，37℃振荡（200r/min）培
养过夜。
c) 向两个装有200mLLB培养液的500mL三角瓶中各加入4mL过夜培养细胞，
37℃振荡培养至光密度（OD600）值在0.5-0.6之间。（约需1h-2h）. d) 将每份细菌培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌250mL离心瓶并置于冰
上保持20min.于4℃下离心10min,（8000r/min）,弃去上清夜。 e) 将每份沉淀轻缓的悬于100mL冰冷的0.1mol/L MgCl2(Ph7.2)溶液中，按
上述方法再次离心。
f) 去上清夜，并将每一份沉淀轻缓的悬浮于20mL冰冷的含20%甘油的0.1
mol/L CaCl2(Ph7.2)溶液中。
g) 分装于微量离心管中，(每支1mL)，－80℃储存备用。 注意：
1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。
2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在－80℃几小时后感受性达到最高值，几
个月内均能维持高水平的感受态。 五.讨论
1.试剂的质量与污染.所用的试剂如CaCl2等应是高质量的,且最好保存于干
燥的暗凉处.整个过程需要注意防止杂菌和其他DNA的污染;所用器皿如离心管.分装用的微量离心管等一定要洗干净,最好用新的;并在整个过程中要无菌操作.少量其他试剂在器皿中残留或DNA的污染均会影响转化率.实验中凡涉及溶液的移取,分装等敞开实验器皿的操作,最好在无菌超净台中进行以防污染. 六.结果分析
实验十、目的基因转化感受态细胞的实验
一.实验目的:
1.了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义. 2.外源质粒DNA转入受体菌感受态细胞并筛选转化体的方法. 二.实验原理:
连接反应中形成的重组子及其他质粒分子的混合体必须通过转入宿主细胞将它们相互分离进而复制(克隆),人们发现用含Ca2=的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA,这一过程被称为转化(transformation).将转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体(transformation),即可能带有异源DNA分子的重组细胞.大肠杆菌的转化过程是将质粒分子溶液或连接反应的混合物与感受态细胞的悬浮液混合放置,将混合溶液于42℃热处理1min-2min（一般90s）,会诱导质粒DNA分子进入细胞,提高转化效率.然后加适量生长培养基液于转化细胞,并在室温下培养,最终涂布于琼脂平板表面,培养至形成细菌单菌落.同一克隆中的所有细胞均起源于某一单独个体的分裂繁殖,因此所有细胞具相同的基因型,这里不包括自发突变,只包括转化步骤中引入的质粒(换言之,即是克隆或克隆群).
在单一亚克隆实验中,要求实验设计应充分体现重组子克隆的产率,例如可采用碱性磷酸酶处理载体.通常的筛选方法是分别从若干克隆中制备质粒DNA,然后用琼脂糖电泳进行分析.本实验以E.coli BL21（DE）3菌株为受体细胞,用CaCl2处理受体菌使其处于感受态,然后PET28a质粒共保温实现转化. PET28a质粒带有卡那霉素抗性基因的特性.将经过转化的全部受体细胞进行适当修饰,在含卡那霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗卡那霉素的能力而死亡,转化体经扩增后,
可将转入的质粒DNA分离提取出来,用于电泳分析,限制型内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验. 三.仪器、材料和试剂
1.仪器和材料: 恒温摇床、电热恒温培养箱、超净台、分光光度计、台式离心机、离心管、大肠杆菌BL21（DE）3、PET28a质粒DNA 、Eppendorf管、移液器、液氮
2.试剂:
（1）基本培养基 在三角瓶中，将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。待冷却至55℃在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/L CaCl2，20mL灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过滤除菌）。
4倍盐溶液：6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5gNaCl,1g NH4Cl,加水至250mL并调pH至7.4）。
（2）LB培养基（1L）将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含氨卞青霉素的LB培养基，则将15克琼脂加1L LB培养液中高压灭菌，待冷却至55℃,向其中加入1.5mL100mg/ml的氨卞青霉素。
（3）0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2(含20%甘油)两者均调pH值至7.2并高压灭菌备用。
（4）TSS溶液:10%PEG 8000,5%DMSO,20mmol/L MgSO4,以上各成分溶于100mLLB培养液中,过滤除菌(由于高压灭菌会使TSS液转化效果下降,PEG可以单独进行高压灭菌). 四.操作步骤
1)氯化钙法制备的感受态细胞的转化
1.将1ng-10ng质粒DNA加于1.5mL无菌离心管中,再用缓冲液(Tris10mmol/L,pH7.7,0.1mmol/L EDTA)将体积调至100mL置于冰上.
2.待感受态细胞在冰上融化后,向含有质粒DNA的离心管中加入200μL,混匀并在冰上静置30min.
3.将离心管放入42℃水浴中90s对细胞进行热处理.
4.向上述试管中加入1mL预热(37℃)的LB培养液,于37℃下振荡培养(200r/min)1h.
5.将50μL-100μL上述培养液平铺于含有合适抗生素的LB固体培养基上, 37℃培养过夜. 五.讨论
(一)为提高转化率需考虑以下几个重要因素:
1.细胞生长状态和密度.细胞生长密度不足或过高均会使转化率下降,一般以每毫升培养液中的细胞数在5x107个范围为好.要使用新鲜的培养液,否则效果不佳.受体菌生长状况可用分光光度计来测定,不同菌株的合适OD值是不一样的,因为OD值与细胞数值之间的关系随菌株的不同而异.
2.转化的质粒DNA的浓度和质量.转化率与所加DNA浓度在一定范围内成正比,但当加入的DNA量过多或体积过大时,则会使转化率下降.用于转化的质粒DNA应主要是cccDNA.
3.若在不该长出菌落的平板长出菌落,首先要考虑是否已失效,若排除了这一因素,则说明实验有污染;如果长出的菌落相当于平板上长出的菌落而言,数量
极少(一般在5个以下),则此次转化还算成功,可继续以后的实验;如果长出的菌落很多,则需设计对照实验,找出原因后,再重新进行转化.
4.本实验方法使用于E.coli各菌株,但同一菌株与不同质粒DNA的转化率是不一样的,有的重组质粒转化率会很低.
(二) 转化是DNA扩增和在体内进行基因研究的关键步骤.转化有多种方法,常用的有氯化钙法,氯化铷法,一步法.与其他两种方法相比一步法很容易,它无需离心,漂洗,热处理以及特殊仪器(如电穿孔法).另外在PEG,DMSO和Mg2+存在的情况下可获得较高的转化率.感受态细胞在不做任何处理的情况下在所在容液中可保存长达3个月以上.
(三)一般认为冰冷氯化钙溶液处理可使细菌进入”感受态”,而热休克则使细菌的细胞膜张开,这样DNA得以进入细胞.迄今人们为提高转化率为这一技术进行了很多改进.本实验所介绍氯化钙是一种简便,快速的方法.使用本法进行转
7
化,每微克超螺旋质粒(pGEM系列)可产生10个转化菌落.
(四) 感受态细胞的质量可以通过测定某一特定样品的转化率来衡量,转化率定义为每微克用于转化的DNA在选择平板所形成的菌落数.这里DNA为纯质粒,通常是在克隆实验中的载体.转化率的变动幅度很大,可以从粗放转化程序的105
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个菌落/ug到精细转化程序高于10个菌落/ug.粗放转化程序只适合将完整质粒转入新的宿主菌,而精细转化程序所精心制备的感受态细胞可用于文库的构建.约105个菌落/ug的转化率足以满足简单克隆实验.
(五) 一般培养液中必须含有原平板筛选转化所用的抗生素,以维持对质粒有无的选择.部分质粒在长期无筛选压力的生长条件下会从宿主菌体内丢失,因为那些偶然丢失了质粒后以耗能小的方式将会淘汰那些携带质粒的细菌.扩增的质粒可以用小量法从培养基中制备.通常在这一时刻要制备培养物的保存液,方法是将培养物分散于含有一定的甘油溶液中冻存,甘油的作用是保护细胞免受冰晶形成的伤害(甘油贮液).这样的贮液能使同一菌株(质粒)在必要使被接种增殖并再次制备这样的贮存液保存. 六.结果分析
实验十一、菌落PCR反应
一、实验目的
掌握应用PCR的方法大量扩增阳性克隆子的技术。 二、实验原理
将细菌在无菌水中煮沸5分钟，其他同质粒和基因的PCR反应。 三、实验仪器、材料及试剂
实验仪器：PCR仪、微量移液管、0.5mlEP管、小枪头、 实验材料：上述筛选试验中获得的筛选平板上的单菌落 实验试剂：PCR所需各种试剂 四、实验步骤
1.用200μL的枪头活无菌牙签从平板上挑取菌落，选取直径大于1mm的菌落，
如要保存菌落拷贝，移动前要轻触平板；
2.将菌转至装有50μL灭菌水的PCR管，震荡使细胞分散；