第一章 绪论
一、细胞生物学概念
? 细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖与分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要内容。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。 三、研究的重点领域
全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：
?细胞信号转导 细胞凋亡?基因组与后基因组学研究
三种疾病：癌症 心血管病 爱滋病和肝炎等传染病 五大研究方向：细胞周期调控 细胞凋亡 细胞衰老 信号转导 DNA的损伤与修复
第二节 细胞学与细胞生物学发展简史 一、细胞的发现（discovery of cell）
1665年，胡克创造了第一架有科学研究价值的显微镜。放大倍数可达40—140倍，并用其做了大量观察，将结果整理成书《显微图谱》（Micrographia）发表于1665年。在书中描绘了他所见到的木栓是由许多蜂巢状小室排成，并称之为细胞（Cell源于拉丁文Cella，原意为空隙、小室、小房子),是细胞学史上第一个细胞模式图。 把综合了细胞结构特点的图解称细胞模式图。 Hooke作为世界上细胞的第一个发现和命名者。 1677年，列文虎克（Antony Van Leeuwenhoek，1632—1723，荷兰布商，科学家）用自制显微镜看到了活细胞。
二、细胞学说的建立及其意义（The cell theory） 1838年，德国植物学家施莱登（J.Schleiden）关于植物细胞的工作，发表了《植物发生论》一文（Beitrage zur Phytogenesis）。
1839年，德国动物学家施旺（T.Shwann）关于动物细胞的工作，发表了《关于动植物的结构和生长一致性的显微研究》一文。
中心思想是：细胞是一切生物体的基本构成单位和功能单位。
细胞学说的创立，对当时生物学的发展起了巨大的促进和指导作用，明确了整个自然界在结构上的统一性，推进了人类对整个自然界的认识，有力促进了自然科学和哲学的进步。
恩格斯给予高度评价，把它与进化论和能量守
恒定律并列为十九世纪自然科学的三大发现。 还有人将其与达尔文的进化论（1859）和孟德尔的遗传学（1865）称作现代生物学的三大基石。实际上，可以说细胞学说又是后两者的基石。 三、细胞学的诞生（细胞学的经典时期和实验细胞学时期）
1953年美国分子遗传学家沃森(J.D.Watson)和英国分子生物学家、物理学家克利克(F.H.C.Crick)这两位生物分子舞台上的名角，提出了DNA分子结构的双螺旋模型，标志着分子生物学的诞生。 五、分子细胞生物学
哪3个有代表意义的细胞模式图？
一、1665年，胡克《显微图谱》描绘了他所见到的木栓是由许多蜂巢状小室；
二、1925年，Wilson魏尔逊绘制了一幅反映了光镜时代对细胞结构认识水平的细胞模式图； 三、1961年，希拉舍（绘制了细胞的超微结构，反映了电镜时代对细胞的认识水平。 小结：
细胞生物学是研究细胞生命活动基本规律的学科，它是现代生命科学的基础学科之一。细胞生物学研究的主要方面包括： ① 生物膜与细胞器；②细胞信号转导；③细胞骨架体系；④细胞核、染色体及基因表达；⑤ 细胞增殖及其调控；⑥细胞分化及干细胞；⑦ 细胞死亡；⑧细胞衰老；⑨ 细胞工程；⑩细胞的起源与进化。
本章回顾了细胞学与细胞生物学发展的简史，阐述了细胞学说的建立及其重要意义，分析了细胞生物学学科形成的基础与条件。细胞学与细胞生物学发展的历史大致可以划分为以下几个阶段：① 细胞的发现；② 细胞学说的建立；③ 细胞学的经典时期；④ 实验细胞学时期；⑤ 细胞生物学学科的形成与发展。当今的细胞生物学是以细胞作为生命活动的基本单位这一概念为出发点，在各层次上探索生命现象的最基本、最核心问题的一门重要的学科。
第二章 细胞的统一性和多样性
第一节 细胞的基本概念
?所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。
?所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。
?作为蛋白质合成的机器─核糖体，毫无例外地存在于一切细胞内。
细胞功能的共性：
?所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 ?细胞都能进行新陈代谢（酶催化控制）
?细胞都具有运动性（自身运动和胞内物质运动） 第二节 原核细胞与古核细胞 基本特点：
? 遗传的信息量小，一个环状DNA构成； ? 细胞内没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核膜。 主要代表：
?支原体（mycoplast）——最小最简单的细胞（0.1-0.3 μ ms， 最小基因组: 482 genes, 最低限度必需gene:256） ?细菌（细菌性疾病）
?蓝藻又称蓝细菌（Cyanobacteria） 原 核 细 胞 细菌性疾病
1．空气传播的细菌病 ：白喉；军团菌热；脑膜炎；百日咳；丹毒；链球菌肺炎；结核病;猩红热； 2．其它细菌病 ：牙菌斑；龋齿; 幽门螺旋杆菌；与A类链球菌感染有关的病症 古细菌
第三节、真核细胞
真核细胞的基本结构体系
1、以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统； 3、由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。 2、以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统
原核细胞与真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较
1、都具有类似的细胞质膜结构
2、都以DNA为遗传物质，使用相同的遗传密码 3、都以一分为二的方式进行细胞分裂 4、转录和翻译机制相似，类似的核糖体结构 5、代谢机制相同（糖酵解和TCA循环） 6、化学能储存机制相同（ATP合成酶） 7、光合作用机制相同（蓝藻和植物相比） 8、膜蛋白的合成和插入机制相同
植物细胞与动物细胞的比较 细胞壁 液泡 叶绿体 第四节 非细胞形态的生命体
病毒（virus）——核酸分子（DNA或RNA）与蛋
白质构成的核酸-蛋白质复合体；
根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类：DNA?病毒与RNA病毒
类病毒（viroid）——仅由感染性的RNA构成； 朊病毒（prion）——仅由感染性的蛋白质亚基构成； 基因组：DNA或RNA，单链或双链，环状或线状。储存遗传信息，是病毒的感染单位。 DNA病毒繁殖的过程
①吸附：病毒通过表面的蛋白与细胞表面的特异的受体分子结合；
②侵染：病毒基因组进入宿主细胞，方式各有不同（胞吞，膜融合，核酸注入）；
③复制：利用宿主细胞提供的整套装置复制其基因组，合成蛋白；
④装配：基因组和核衣壳蛋白自发地组装成病毒粒子；
⑤释放：细胞会被裂解，释放出子代病毒，继续新的感染周期。
RNA病毒在细胞内增殖
1、病毒侵入细胞，病毒核酸的侵染 2、病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成 3、病毒的装配、成熟与释放 病毒与人类
1、病毒的发现与分类
2、病毒的基本特征 小，结构简单—滤过性病毒 DNA或RNA—DNA病毒和RNA病毒 彻底的寄生性，繁殖方式：复制与装配
病毒是非细胞结构的生命体，是迄今发现的最小，最简单的生命体 3、病毒的物种及其分类
分类： 命名(宿主，病症，发现地等） 宿主(动物，植物，微生物） 核酸型（DNA or RNA) 繁殖方式 （裂性，温和性） 4、病毒与人类疾病--- 病毒性疾病
1．节肢动物媒介的病毒病 ：斑疹伤寒；鼠疫 2．直接接触传播的病毒病：炭疽；淋病；麻风病；梅毒；破伤风；砂眼；AIDS
3．食物和水传播的病毒病：肉毒中毒；霍乱；伤寒；脓毒性休克； 小结：
细胞是一切生命活动的基本单位，包括以下几个方面的涵义：（1）一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的形态结构单位。构成多细胞生物体的细胞虽然是“社会化”的细胞，但它们又保持着形态结构的独立性，每一个细胞具有自己完整的结构
体系。（2）细胞是有机体代谢与执行功能的基本单位，在细胞内的一切生化过程与试管内的生化过程的根本不同点，是细胞有严格自动控制的代谢体系，并且有保证完成生命过程有序性的独立的结构装置。（3）有机体的生长与发育是依靠细胞增殖、分化与凋亡来实现的。细胞是研究有机体生长与发育的基础。（4）细胞是遗传的基本单位，每一个细胞都具有遗传的全能性（除少数特化细胞）。构成各种生物机体的细胞的种类繁多，结构与功能各异，但它们都具有基本共性：细胞膜，两种核酸（DNA与RNA），蛋白质合成的机器——核糖体与一分为二的增殖方式，这些是细胞结构与生存不可缺少的基础。种类繁多的细胞可以分为原核细胞与真核细胞两大类。近年认为原核细胞并不是统一的一大类，建议将细胞划分为原核细胞、古核细胞与真核细胞三大类。支原体是迄今发现的最小最简单的细胞，它已具备细胞的基本结构，并且有作为生命活动基本单位存在的主要特征。作为比支原体更小更简单的细胞，又要维持细胞生命活动的基本要求，似乎不大可能。
细菌与蓝藻是原核细胞的两个重要代表。原核细胞的共同特征：没有核膜、遗传信息载体仅仅是一个裸露的环状DNA分子，除核糖体与细胞质膜及其特化结构外，几乎不存在其他复杂的细胞器。将原核细胞与真核细胞进行比较，从进化与动态的观点分析，主要有两个基本差异：一是以生物膜系统的分化与演变为基础，真核细胞形成了复杂的内膜系统，构建成各种具有独立功能的细胞器，双层核膜将细胞分隔为细胞核与细胞质两个基本部分；二是遗传结构装置的扩增与基因表达方式的相应变化。由于上述的根本差异，真核细胞的体积也相应增大，内部结构更趋复杂化，生命活动的时间与空间的布局更为严格，细胞内部出现精密的网架结构——细胞骨架。
古核细胞在形态结构、遗传装置虽与原核细胞相似，但一些基本分子生物学特点又与真核细胞接近。
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术 (light microscopy) ?电子显微镜技术 (Electro microscopy) ?扫描遂道显微镜 (scanning tunneling 光学显微镜： ◆普通双筒显微镜
◆荧光显微镜 ◆相差显微镜 ◆激光共聚焦显微镜 细胞形态结构的观察方法
——显微镜技术 电子显微镜： 透射电镜 扫描电镜 扫描隧道显微镜
细胞形态结构的观察方法——光学显微镜 （一）普通复式光学显微镜
光学显微镜的分辨率（Resolving power D） 提高分辨率： 增大数值孔径 缩短波长 （二）暗视野显微镜（darkfield microscope） 根据丁达尔效应的原理设计而成，在显微镜中安装特殊聚光器，使得照明光线不能直接进入物镜，而是只允许被标本反射或折射的光线进入物镜，这样视野背景是暗的，而物体的边缘是亮的，使样品在暗的背景上显得更加突出。适于观察细胞的运动和外部形态，而内部结构观察不清。 （三）相差显微镜（phase contrast microscope） 能将物体本身的相位差转换为振幅差的显微镜。 在普通光镜下观察标本时，是靠颜色（波长）和亮度（振幅）的差别而看到被检物体的结构。 活细胞近于无色透明，光波通过不吸收光，振幅变化不大，故人眼感觉不到。 1. 分离直射光和衍射光
2. 使直射光和衍射光之间产生干涉，使相位差变成振幅差, 表现为明与暗的对比
——用于观察未染色样品, 能够观察到无色透明的活的物体。
（四）荧光显微镜（fluorescence microscope） 以紫外线为光源，照射被检物体发出荧光，在显微镜下观察形状及所在位置。
荧光显微镜可以观察细胞内天然物质经紫外线照射后发荧光的物质，如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光。也可观察诱发荧光物质，如用丫啶橙染色后，细胞中RNA发红色荧光，DNA发出绿色荧光，根据发光部位，可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。
（五）激光共聚焦显微镜 (confocal scanning microscope) （六）倒置显微镜
■物镜与照明系统的位置颠倒
■集光器与载物台之间的工作距离提高,可以放置培养皿、培养瓶等容器,直接对培养的细胞进行照明和观察
光镜标本制备技术 ? 细胞染色技术 组织固定和切片技术
细胞形态结构的观察方法 —— 电子显微镜 如果利用电子穿透样品成象而设计成电镜，则为透射式电子显微镜，反映样品内部的状况。 如果利用二次电子成象设计成的电镜，则为扫描式电镜，反映样品的表面立体形貌。 由四大部分组成:
●电子束照明系统： 电子枪，聚光镜 ●成像系统： 物镜、中间镜与投影镜 ●真空系统： 是保持电镜的真空度 ●记录系统： 荧光屏或感光胶片等 电子显微镜的基本结构 一、电子显微镜的种类及原理
a. 透射电子显微镜；b. 扫描电子显微镜 要求 样品超薄 保持精细结构 样品反差强 超薄切片过程
1.固定2.包埋(环氧树脂) 3.切片(600埃) 4.染色(醋酸铀与铅盐) 5. 观察 扫描电镜
用电子束去扫描样品表面，电子束激发样品表面放出二次电子，由探测器收集，形成立体感强的图。主要用于观察样品的表面结构
扫描电镜样品制备：固定、干燥、均匀镀上重金属膜、观察
冷冻断裂(freeze-fracture):
将样品迅速冷冻，用冰刀横切断裂，然后喷镀上重金属，用于电镜观察。 冷冻蚀刻 (freeze etching)：
在冷冻断裂技术基础上，让冷冻断裂的样品的温度稍微升高，样品表面的冰升华，在表面浮现出更多结构。
扫描电镜 果蝇的复眼
透射电镜过氧化氢酶 (catalase)与抗体结合后，抗体再与金颗粒结合，在电镜下定位在过氧化物酶体中 扫描隧道显微镜
用扫描探针对样品表面进行扫描，探针与样品的距离达到数A时，导致样品表面电子云发生重叠，在样品和针尖之间产生隧道电流，可获得样品表面的原子排列图像。
?用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。
◆DNA结构研究
◆胶原、纤维和蛋白质结构研究 ◆细胞膜表面结构的研究 第二节 细胞及其组分的分析方法 一、离心技术分离细胞组分 差速离心
原理：不同沉降系数的组分在不同的离心速度下沉降的速度不同，以此用来分离亚细胞组份。 等密度梯度离心
原理：离心介质以连续密度梯度分布，通过离心、每种物种悬浮到与自己密度相当的介质区 如：分离不同的DNA分子 －富含AT和富含GC的DNA
二、细胞成分的细胞化学显示方法
? 原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量
组织化学和细胞化学法
基本原理 利用某些化学物质和某些细胞成分发生化学结合，从而显示出一定的颜色，进行定性和定位研究的方法。
1、 Feulgen reaction 酸水解去除RNA，并除去嘌呤，醛基与schiff试剂作用形成紫红色。 2、 Brachet reaction 甲基绿——派罗宁染色显示RNA
3、 P.A.S reaction 过碘酸氧化作用破坏多糖的1，2—乙二醇基，使醛基暴露，与Schiff试剂作用显示紫红色。
4、 四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，由此证明脂肪滴的存在。
5、 苏木精—伊红染色（（Hematoxylin—Eosin，H·E染色法）苏木精是细胞核、伊红是细胞质的优良染料。结果：核呈蓝紫色，质呈桃红色。
6、 姬姆萨染色法 Giemsa属复合染料，核红紫色，质蓝色。
7、 吖啶橙荧光染色法 核DNA呈黄绿至亮绿荧光，胞质、RNA、核仁呈桔红色荧光。吖啶橙染色的细胞，形态清晰，颜色鲜明，并能粗略地反映细胞内两种核酸的相对含量。 死活细胞鉴别
1、 染色排除法 以死细胞和活细胞对色素的不同
吸附来鉴别。
死细胞着色：大多为酸性染料，易穿透死细胞质膜进入胞内，不能进入活细胞。这类染料有：台盼蓝、苯胺黑、赤藓红B、伊红Y等。
2、 吖啶橙法 采用此法可鉴别出固定之前细胞的死、活状态。已知吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝光或紫外光激发下:原来的活细胞，其核呈亮绿色，核仁、RNA呈桔红色，胞质呈淡红褐色。原来是已经死亡的细胞，核呈暗绿色，胞质呈亮铜色。 各种细胞器的显示
1、 细胞核及染色体的染色
(1) Giemsa染色液 常规用，效果好。
(2) 醋酸地衣红 显示有丝分裂染色体细微结构。 2、 内质网 采用荧光染料 （1）Dioc6
（2）Hexyl ester of rhodamine（R6）绿光激发→红色。
（3） （已二基十二烷氧杂喹啉花青素）蓝光激发呈蓝绿色。 3、 高尔基体
（1）Baker苏丹黑B染色法 呈黑色囊泡。 （2）荧光染色活细胞中的高尔基体。 荧光探针NBD—hexanoic caramide，蓝光激发，高尔基体呈绿色荧光。 4、 溶酶体 5、 线粒体
(1) Heidenhain 铁苏木精染色法
结果：线粒体深蓝至蓝黑色，间期细胞只有线粒体着色。
(2) Janus green B活染线粒体 结果：线粒体蓝绿色。 (3) 罗丹明123活染线粒体
结果：蓝光激发，线粒体发绿色荧光。 6、 叶绿体
由于该细胞器形态较大，本身富含叶绿素，故不用染色便可观察。常用材料：君子兰、虎眼万年青、水绵、双星藻等。 三、特异蛋白抗原的定位与定性
免疫荧光技术：将免疫学方法与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 免疫电镜技术：能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
四、细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
PCR?技术 核酸分子杂交技术（特异核酸的定性定位） 一、概念
两条具有互补核酸顺序的单链核酸分子片断，在适当的实验条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双链分子的过程。 二、基本原理
当溶液中的DNA分子经高温或高pH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或pH恢复中性，那么两条单链会按照硷基互补配对原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条链的来源不同，只要它们之间的硷基顺序是同源互补的或者部分同源互补，那么，便可形成全部或部分复性，即产生分子杂交。 DNA变性：又称熔解，指DNA双链在加热（100℃）或改变PH值（PH≥13）时引起氢链打开，使两股链分离的过程。能引起DNA双链解离为单链的温度称为熔解温度（Tm）。
DNA复性：又称退火，变性后的DNA单链，当温度缓慢下降冷却时（65℃），互补的单链又可通过碱基配对，重新形成DNA双链（double stranded）的过程。
通常两种待杂交的分子之一是已知的并且预先用同位素标记，称为“分子探针”，以识别另一种核酸分子中与其同源的序列。
一般利用：测定单链分子核酸顺序间的互补关系，某一基因的拷贝数，以及非对称性转录等方面的信息。
三、杂交方法
（一）液相核酸分子杂交 （二）固相核酸分子杂交
在固相核酸分子杂交技术中，无论采用哪一种基质，都是将变性DNA吸印固定于支持介质上，再与“标记分子”进行杂交。这便是所谓的印迹杂交或称印迹术（blotting）
（三）印迹杂交 (blot hybridization)
用已知的带有标记的特定核酸分子（或抗体、蛋白质分子）作为探针，与通过印迹被转移的核酸