分子（或抗原、蛋白质分子）片段杂交的过程。 印迹：通过电泳或毛细管作用将凝胶电泳分离开的DNA、RNA或蛋白质转移到某一种基膜（常用硝基纤维素膜）上的过程。由于此过程类似于把墨渍吸到吸墨纸上而称为blotting。
常用基膜：DBM滤纸、硝基纤维素膜、尼龙膜。 根据转移的成分不同，印迹术可分为DNA印迹术、RNA印迹术和蛋白质印迹术。 1 Southern blotting （DNA印迹法） 2 Northern blotting （RNA印迹术） 3 Western blotting（蛋白质印迹术）
4 Eastern blotting（Western blotting的变形）对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 5 DNA与蛋白质的体外吸附技术
结合了Western印迹与southern印迹两种实验方法的特点而设计的一种检测序列特异性DNA结合蛋白的实验方法。用以研究DNA和蛋白质的相互作用，将PAGE后的蛋白质分子，通过电泳转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后用同位素标记的DNA探针进行吸附，这样与DNA有亲和作用的蛋白质条带便可显示出放射自显影条带。 6 原位杂交（Insitu hybridization）
用标记的核酸探针，通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。 “探针”（probe）制作：
用放射性同位素对已知核酸（DNA或RNA）进行标记的过程。分活体内（in vivo）标记和体外（in vitro）标记。
五、定量细胞化学分析与细胞分选技术
流式细胞仪(flow cytometry)：通过鉴定细胞表面特征蛋白所结合的荧光素或染色体特异结合的DNA探针的荧光，分选细胞或染色体。 主要应用：
定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。 第三节 细胞培养与细胞工程 一、细胞的培养 动物细胞培养
类型：原代培养细胞（primary culture cell）
传代培养细胞（subculture cell） 原代细胞→有限细胞系→永生细胞系 约传10代 40-50代 无限制传代
植物细胞培养
类型： 原生质体培养 （体细胞培养）
单倍体细胞培养（花药培养） 动物细胞培养：
物质营养 – 培养基，含血清的合成培养基 生存环境 – 无菌、温度、渗透压和气体O2和CO2 废物的排除 – 定期更换培养液
植物组织培养：根据植物细胞全能性发展起来的利用植物植株的不同组织培养成完整植株的方法。 植物原生质体培养：采用植物二倍体体细胞，先经纤维素酶处理去掉细胞壁形成原生质体，再用合适的培养基诱导分化重新长成植株。 1）细胞培养（cell culture）
指细胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，细胞不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群
2) 组织培养（tissue culture）
指组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化并保持组织的结构与功能。培养物是组织碎块或器官的一部分
3）器官培养（organ culture）
指器官的胚芽、整个器官在体外条件下的保存或生长，此时亦能有器官的分化并保持器官的立体结构和功能
in vivo 在体、活体、生物体内 in vitro 离体、生物体外 连续细胞系（cell line）
原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。由原先存在于原代培养物中的细胞世系（多种细胞）所组成
目前常用的细胞系有：3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）；CHO（正常中国仓鼠卵巢细胞）；Hela（人宫颈癌细胞)亚二倍体，接触抑制丧失 细胞株（cell strain）
通过选择法或克隆形成法从原代培养物中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。这种特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。在描述某一细胞株时，必须说明它的特殊性质或标志。正常二倍体，接触抑制 克隆（clone）
又称无性繁殖系或无性系，指由一个细胞或共同祖先通过有丝分裂所产生的遗传特性一致的细胞群或生物群，亦指DNA片段群
上皮样细胞：指形态规则，边缘清晰，排列紧密的
六角形细胞
成纤维样细胞：棱形的平行排列或交叉成网的细胞 接触抑制和密度依赖性
当培养细胞分裂增殖相互间密切接触时，细胞停止活动的现象为接触抑制。（非正常细胞如癌细胞除外）。
二、细胞工程(Cell Engineering)
细胞工程之基础——细胞培养：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，使之生存和生长的技术。
细胞工程涉及的主要技术：细胞培养；细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等
细胞工程：在细胞水平上有计划的保存、改变和创造细胞遗传物质，以产生新的物种和品系，或大规模培养组织细胞以获得生物产品。
细胞融合：两个或多个细胞自然或经人工诱导而合并成单个细胞的过程，
其中人工诱导细胞融合一般另称作“细胞杂交” 细胞融合方法： 病毒介导法
PEG（聚乙二醇）介导法 电脉冲介导法 激光介导法 融合细胞类型：
同核融合细胞——同核体（homokaryon） 异核融合细胞——异核体（heterokaryon） 单克隆抗体制备
B淋巴细胞可产生抗体，但不能无限繁殖，与肿瘤细胞融合后就可以无限增值。把产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术。 细胞拆合
通过一定的实验技术，从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其装配成具有生物活性的细胞或细胞器
这一技术首先要制备核体和胞质体，物理法结合显微操作技术
化学法结合离心技术制备
小细胞（minicell）又称核体，具有细胞核、带有薄层细胞质
胞质体（cytoplast,cytosome)重组细胞，除去细胞核后由细胞膜包裹的结构，胞质体与核体的融合 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 荧光漂白恢复技术
单分子技术与细胞生命活动的研究 酵母双杂交技术 荧光共振能转移技术 放射自显影技术
一、荧光漂白恢复技术Fluorescence Photobleaching Recovery ，FPR
可以用于解决活细胞表面及胞内包括蛋白定位，动力学以及与其他成分相互作用等一系列问题。 二、单分子技术：是在细胞内实时观测单一分子运动规律的技术。可在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单分子的距离、位置、指向、分布、结构及各种动态过程。
常见方法：光镊、磁镊和原子力显微镜。 三、酵母双杂交技术：
1989建立，在活细胞内研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
转录激活因子：DB（DNA结合域制作诱饵），AD（转录激活域制作猎物） 四、荧光共振能量转移技术FRET
FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可以检测某一细胞中两个蛋白是否存在直接的相互作用
供体蛋白与受体蛋白无相互作用（B）和有相互作用（C）时的荧光变化(距离在5－10nm的范围内 )。FRET效率反映了体内两种蛋白是否直接相互作用及作用的强弱
五、放射自显影（Radioautography）
它是利用卤化银乳胶现象,检查和测量放射性的一种方法。利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物 本章小结
细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light microscopy） 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 细胞组分的分析方法 离心分离技术
细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 核酸分子杂交技术 细胞培养与细胞工程 动物细胞培养：原代，传代 细胞融合与单克隆技术
动物克隆
细胞及生物大分子的动态变化 荧光漂白恢复技术 单分子技术 酵母双杂交技术 荧光共振能转移技术 放射自显影技术
第五节 模式生物与功能基因组的研究
生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式生物
易培养，快生长，体积小 ，快速学习，基因组序列
没有通用的模式生物，只有最适合研究某些问题的模式生物。 一 常用模式生物
发育研究中常用的模式生物 （一）大肠杆菌
应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系；
构造相对简单，遗传背景清晰，培养操作容易； 基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个环状质粒DNA。 （二）酵母
这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 （三）线虫 （四）果蝇 （五）斑马鱼 基本的生物学特征
胚胎透明，发育快：－－适合胚胎学研究 后代数量大 (雌鱼每周能产几百枚卵)－－适合遗传学分析
个体小：－－易于大规模饲养，养殖成本低 心血管系统发育缺陷的斑马鱼依然能够通过气体交换存活数天
其血管发生与形成过程与哺乳动物相比有很高的保守性
斑马鱼：理想的模式脊椎动物，斑马鱼是进行心血管发育机制研究的理想模式脊椎动物 （六）小鼠
体型小生长期短、成熟早、繁殖力强
性情温顺，胆小怕惊，对环境变化敏感，品种和品系很多，是实验动物中培育品系最多的动物 （七）拟南芥
植株形态个体小，高度只有30cm左右，生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；种子多，每株每代可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。
随着生命科学研究的发展，还会有新的物种被人们用来作为模式生物。但它们会有一些基本共同点： 1）有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大类群；
2）对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖；
3）世代短、子代多、遗传背景清楚； 4）容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。 二、突变体制备技术 （DNA与RNA水平）
RNAi技术，RNA水平制备突变体一种方法。 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 基因敲除
DNA水平制备突变体的一种方法。 三、蛋白质组学技术
生命活动的认识——细胞内各种蛋白质功能及其相互协同作用
蛋白质组——一种基因组所表达的全部蛋白质 蛋白质分离技术
双向电泳、多维液相色谱、毛细管电色谱等 蛋白质鉴定技术 （一）双向凝胶电泳 原理：
第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 存在问题： 低拷贝蛋白的鉴定
极酸或极碱蛋白的分离 极大（>200kD）或极小（<10kD=蛋白的分离 难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 （二）色谱技术
原理：利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离 （三）质谱 原理：
使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 种类：
气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） 液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）
基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS）， 傅里叶变换质谱仪（FT-MS） （四）蛋白质芯片 原理：
对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），
根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析 应用：
蛋白质表达谱分析， 蛋白质与蛋白质的相互作用，
DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用， 筛选药物作用的蛋白靶点等 （五）生物信息学
生物信息学（Bioinformatics）是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。
其研究重点主要体现在基因组学（Genomics）和蛋白质组学（Proteomics）两方面，具体说就是从核酸和蛋白质序列出发，分析序列中表达的结构功能的生物信息。 研究方法：
数据库的建立 生物学数据的检索 生物学数据的处理
生物学数据的利用：计算生物学 NCBI(美国国立生物技术信息中心) 本章小结 常用模式生物
大肠杆菌，酵母，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠 拟南芥
蛋白质组学技术 蛋白质分离技术
双向电泳、多维液相色谱、毛细管电色谱等 蛋白质鉴定技术
质谱、蛋白质芯片、生物信息学等
第四章 细胞质膜
细胞质膜(cell membrane)又称质膜（plasma membrane），是指围绕在细胞最外层，由脂质和蛋白质组成的生物膜。
真核细胞的生物膜（biomembrane）包括细胞的内膜系统（细胞器膜和核膜）和细胞质膜（cell membrane）。
第一节 细胞质膜的结构模型与基本成分 一、细胞膜结构的研究历史
3. J. Danielli & H. Davson 1935 提出了“蛋白质-脂类-蛋白质”的三明治模型。认为质膜由双层脂类分子及其内外表面附着的蛋白质构成的。1959年提出了修正模型，认为膜上还具有贯穿脂双层的蛋白质通道，供亲水物质通过。
4. J. D. Robertson 1959 用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片，显示暗-明-暗三层结构，厚约7.5nm。这就是所谓的“单位膜”模型。 5. “流动镶嵌模型”。 质膜的流动镶嵌模型的特点
组成成分：主要组成成分为脂类和蛋白质，还含有少量的糖类。
不对称性：蛋白质或嵌在脂双层表面，或嵌在其内部，或横跨整个脂双层，表现出分布的不对称性。流动性：膜蛋白和膜脂可作各向运动。
6. Simon 1988年提出脂筏模型（lipid raft model）： 生物膜上的脂质以甘油磷脂双分子层为主；胆固醇和鞘磷脂富集区域形成相对有序的脂相，如同漂浮在脂双层上的“脂筏”；各种膜蛋白如同其它脂质一样。
7. 生物膜结构的归纳认识
具有极性头部和非极性尾部的磷脂分子在水相中自发形成封闭的膜系统；
蛋白质分子及其它膜酯分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或其表面；
生物膜可以看成双层脂分子中嵌有蛋白质的二维溶液，存在相互作用；
细胞生命活动过程中，可出现弯曲、折叠、延伸等改变，处于动态变化中。 二、膜脂
膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型。 （一）磷脂
是构成膜脂的基本成分，约占整个膜脂的50％以上。磷脂为双型性分子（amphipathic molecules）或双亲媒性分子或兼性分子。 磷脂分子的结构特征：
a. 一般有一个极性头（磷酸和碱基）和两个非极性的尾（脂肪酸链）；
b. 脂肪酸碳链为偶数，16，18，20个C； c. 含有不饱和脂肪酸(油酸)，多为顺式。 类型：分为甘油磷脂和鞘磷脂。 1、甘油磷脂
以甘油为骨架的磷脂类，在骨架上结合两个脂肪酸链和一个磷酸基团，胆碱、乙醇胺、丝氨酸或肌醇等分子籍磷酸基团连接到脂分子上。 主要类型有：
磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline，PC，旧称卵磷脂）
磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine，PS） 磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine ，PE，旧称脑磷脂）
磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol，PI）等。 2、鞘磷脂
鞘磷脂（sphingomyelin，SM）在脑和神经细胞膜中特别丰富，亦称神经醇磷脂，它是以鞘胺醇（sphingoine）为骨架，与一条脂肪酸链组成疏水尾部，亲水头部也含胆碱与磷酸结合。原核细胞和植物中没有鞘磷脂。 （二） 糖脂
存在于原核和真核细胞的质膜上，其含量约占膜脂总量的5％以下，在神经细胞膜上糖脂含量较高，约占5-10％。糖脂也是两性分子，结构与磷脂相似，由一个或多个糖残基代替磷脂酰胆碱而与鞘氨醇的羟基结合。
最简单的糖脂是半乳糖脑苷脂，它只有一个半乳糖
残基作为极性头部；
变化最多、最复杂的糖脂是神经节苷脂。儿童所患的家族性白痴病（Tay-sachs disease）和神经节苷脂有关。 （三）固醇
只存在于真核细胞膜上，含量一般不超过膜脂的1/3，植物细胞膜中含量较少。它是一种双性分子。
功能：调节脂双层流动性，增加膜的稳定性，降低水溶性物质的通透性，生物活性分子的前体化合物（Vd）。 膜脂的分子运动
1 侧向扩散运动 2 旋转运动 3 摆动运动 4 伸缩震荡运动5 翻转运动 6 旋转异构化运动 （四）脂质体
脂质体（liposome）是根据磷脂分子在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的一种人工膜。脂质体可用于细胞膜的研究；转基因；疾病的诊断及治疗。
膜脂的功能：
1）支撑，膜脂是细胞的骨架；
2）维持构象并为膜蛋白行使功能提供环境； 3）是部分酶行驶功能所必需的。 三、 膜蛋白
膜蛋白是膜功能的主要体现者。酵母核基因组编码的蛋白质中约1/3为膜蛋白。
根据与膜脂的结合方式以及在膜中的位置的不同，膜蛋白分为内在蛋白（integral protein）、外周蛋白（peripheral protein）和脂锚定蛋白（lipid-anchored protein）。
一）内在蛋白（integral proteins）
内在蛋白为两性分子。它与膜结合非常紧密，只有用去垢剂（detergent）才能从膜上洗涤下来，常用SDS和Triton-X100。
内在蛋白的跨膜结构域形成亲水通道有两种形式，一是由多个α螺旋组成亲水通道；二是由β折叠组成亲水通道。
（二）内在蛋白与脂膜的结合方式：
膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。跨膜结构域两端带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带负电 的极性头形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过Ca2+、Mg2+ 等阳离子与带负电的磷脂极性头相互作用。膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子,插入脂