冷拉钢丝的拉力。
（2）胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本组成单位是原胶原蛋白分子
（3）一级结构分析表明，胶原蛋白?肽链的96%都是按三联体的重复顺序：(g1y—x—y)n排列而成。Gly数目占残基总数的三分之一，x常为Pro，y常为OH-pro(羟脯氨酸)和OH-lys（羟赖氨酸）。
（4）胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，这是一种右手超螺旋结构。螺距为8.6nm，每圈每股包含30个残基。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺圈含3.3个残基,每一残基沿轴向的距离为0.29nm
（5）原胶原蛋白分子在胶原纤维中都是有规则地按四分之一错位，首尾相接，并行排列组成纤维束。
（6）原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。在电子显微镜下，胶原纤维呈现特有的横纹区带，区带间距为60-70 nm，其大小取决于胶原的类型和生物来源。
蛋白质的四级结构：
定 义：蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。
这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位(Subunit)，它一般由一条肽链构成，无生理活性或不具有完整生理活性。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。 四级结构的类型：
（1）同聚体：由相同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白 （2）异聚体：由不同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白 （3）根据亚基的数目可以称：同**聚体，异**聚体
四级结构的维系：疏水力是维系四级结构的主要方式；亚基之间的契合关系。 寡聚蛋白质与别构效应： 别构效应（allosteric effect）：指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象
别构蛋白质（allosteric protein）：具有别构效应的蛋白质，多为寡聚蛋白，包括活性部位和调节部位
同位效应：指别构蛋白质与一种配基的结合对于该蛋白和同种配基的结合能力的影响
正协同效应 ：第一个配基的结合引起第二个，第三个…配基更容易结合。这种同位效应称正协同效应
负协同效应 ：第一个配基的结合导致第二个，第三个 … 配基更难结合，这种同位效应称负协同效应
异位效应：如果蛋白质分子中，相互之间发生作用的部位是不同的，也即活性部位上所发生的反应将受到调节部位与效应物结合的影响，称异位效应 血红蛋白的结构与功能：
组成：4个亚基组成，成年人红细胞由?、?两种亚基各两条构成。 每条肽链都卷曲成球状，都有一个空隙容纳一个血红素，它们都能与氧气结合。以?2?2四聚体 形式存在一分子Hb能与4分子氧气结合。 分析Hb与氧气结合，发现Hb的4个亚基和4个氧气结合时平衡常数（Keq）并不相同。而是有4个不同的平衡常数，Hb与最后一个氧气结合时其结合力最大。 Hb与氧气结合将影响其四级结构，即亚基与亚基之间的相对位置发生变动，这种变化增强了Hb和O2的亲和力 蛋白质各级结构之间的相互关系： 各级结构之间的递进：
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一级结构对高级结构的指导作用：一级结构是高级结构的基础；高级结构由一级结构和其他构象指导因素共同决定；（最低势能原则：分子的稳定构象往往是该分子内结构势能最低的状态）微环境和折叠辅助因子的影响。 高级结构对低级结构的影响。
蛋白质（III）——蛋白质的主要研究技术
蛋白质的性质：
（一）胶体性质：蛋白质分子直径在1~100nm范围内 透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开。丁达尔现象。水化现象。吸附现象。 （二）酸碱性质：
等电点与电场迁移：蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移
一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用氨基酸侧链基团推算。 （三）蛋白质的颜色反应：
①双缩脲反应：与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。
②米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这是酚类化合物的反应（Tyr）
③乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲哚基化合物的反应（Trp），明胶一般无此反应
④坂口反应：蛋白质加入次氯酸、?-萘酚、氢氧化钠可以生成红色化合物，胍基反应（Arg） ⑤酚试剂：福林（Folin）试剂，酚基（Tyr）可以把磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，Lowry法。
（四）光吸收性质：蛋白质在280nm处有强烈的光吸收，Phe、Tyr、Trp，其Trp贡献最大。 蛋白质的沉淀与变性：
沉淀作用：蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 （1）可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白质和其他物质分开：
①等电点沉淀法：调整pH至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离；适用于区分等电点差异大的亲水蛋白
②盐析与盐溶法：中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用；常用盐析剂：MgCl2、（NH4）2SO4、K2SO4
③有机溶剂沉淀法：改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用；常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质
（2）不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。
变性沉淀因素：高温，强酸碱，重金属盐，有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱，去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠）。
变性后蛋白质化学性质的改变：生物活性丧失，侧链基团暴露（颜色反应增强）。物理化学
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性质改变：溶解性?、粘度?、扩散系数?。生物化学性质改变：易于酶解。 蛋白质的分离纯化一般流程：
（1）前处理：分离组织、破碎细胞、去其他组分（注意问题：保持蛋白质的完整和活性） 常用方法：超声粉碎，微研磨，酶消化，超速离心 （2）粗分级
常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂
要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能收缩蛋白质溶液 （3） 细分级：进一步提纯
常用方法：层析、电泳（规模小，分辨率高）
（4）结 晶：只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶。（结晶不一定意味着蛋白质已提纯） 本身有一定提纯作用。 蛋白质的纯度鉴定：
①活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性检测来确定纯度 ②抗原抗体效价法
③电泳、层析、超离心等方法
④恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否提纯。
⑥根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等 蛋白质分离纯化常用技术：
（一）沉降分离（Sedimentation）：蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异。
（1）差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质。单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关。在生物化学中常用沉降系数（S）表征分子量：
定义：单位离心力场下的沉降速度 mp，分子颗粒质量 （1-??）为浮力因子 f：摩擦系数
Svedberg单位：10-13秒，S
（2）密度梯度离心：利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质。常用蔗糖，CSCl等构建。
（二）层析、色谱（Chromatography）： （1）分配层析： 一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质。
常用方式：分配柱层析，滤纸层析，薄层层析，离子交换层析，气相色谱
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高效液相色谱（HPLC）：利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积；溶剂系统采用高压，提高系统速度。 （2）离子交换层析：
原理：利用不同离子在不同的pH下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质。
可分为：阳离子交换柱：强酸型、弱酸型 ； 阴离子交换柱：强碱型、弱碱型 常用介质：聚苯乙烯-苯二乙烯树脂，离子交换纤维素，离子交换葡聚糖 洗脱方式：分段洗脱，梯度洗脱。
（3）分子排阻层析（molecular-exclusion Chromatography） 原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。又称凝胶过滤、分子筛。
一般步骤：①柱平衡，②蛋白质混合物上柱 ，③洗脱液洗脱蛋白，④收集记录。
可以用于分析分子量：分子量与洗脱体积相关；排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的分子量。 （4）亲和层析（Affinity chromatography）： 原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开 一般步骤：①制备交联有配体的层析柱；②蛋白质上样，平衡；③杂质洗脱；④可溶性配体洗脱目标蛋白质
（三）电 泳（elecctrophoresis）：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳 电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率：
带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用
? F(电场力)=qE(=qU/s) ? f(摩擦力)=fv
? q＝颗粒所带的电量
E＝电场强度或电势梯度＝U/s
U＝两电极间的电势差(以伏特表示) S= 两电板之间距离(以厘米表示)
f＝摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关) v＝颗粒泳动速度(以厘米／秒表示)
? 当颗粒以恒速移动时，qE=fv ，即：v/E=q/f ，在一定的介质中对其一种蛋
白质 来说q/f是一个定值，因而v/E也是定值，它被称为迁移率或泳动度：u=v/E
常见电泳形式：
（1） 界面移动电泳：在U型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电泳过程中液面的移动来记录电泳结果。血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类
（2） 区带电泳：在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成不同区带，可
以区分不同蛋白质。滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳
（3）SDS-盘式凝胶电泳：
1. 用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩胶和分离胶两部分. 2. 浓缩胶一般孔径较大，pH6.8，分离胶一般孔径较小，pH8.8 3. 样本加入SDS（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，使蛋白质分子带上均匀的负
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电荷，分子形状变为一致的杆状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。 4. 具有：样品的浓缩效应 ，凝胶对分子的筛选效应 。 5. 可以用于测定蛋白质分子量，以标准分子量的蛋白质做对照，迁移率与分子量的对数成反比。
6. 蛋白质可用考马斯亮蓝或者苯胺黑染色，也可将其转移到醋酸酯膜上，用相应的抗体鉴定，称west blotting
7. 样本与凝胶之间没有共价的结合，可以将电泳后的样本回收，复性后，将保持其功能。 （4）等电聚焦电泳：利用蛋白质在等电点的pH时不会发生电场迁移的原理，缓冲液或固定介质中构建pH梯度，蛋白质“聚焦”在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带，从而区分不同的蛋白质。区分精度可以到0.02pH。
酶（I）——酶通论与酶促动力学
高效的生物催化剂——酶：
酶是生物催化剂，具有催化剂的普遍性质：提高反应速度，不改变平衡点；降低反应的活化能；自身在反应完成前后不发生改变 不同于非酶催化剂的方面：
（1）催化效率高，可以提高反应速度108~1020，比非酶催化剂催化效率高出107~1013倍 （2）具有高度的专一性，一种酶只作用于特定的一类甚至是一种物质，该物质称酶的底物（Substrate）
（3）酶容易失活，比一般催化剂要求的条件严格
（4）酶的催化能力受到严格的调节控制，如抑制剂、共价修饰、反馈调节、酶原激活、激素调剂等
（5）化学本质不同，酶是高分子物质，常带有辅酶、辅基 （6）酶促反应常表现出底物饱和性 酶的生物学意义:
（1） 生命现象是由酶催化的多步反应的整合：营养素分子的分解；化学能的贮存和转换；从小分子前体合成生物大分子。
（2）酶是生物过程所必需的：在生理条件下无催化剂许多反应进行的太慢，不能适应生命的要求；由于细胞内环境的特殊，没有酶作为催化剂时许多生化反应不能进行 （2） 酶的研究是理解生命过程的必由之路：遗传现象的基础，帮助我们理解生物个体差异的由来，遗传缺陷引起代谢紊乱的机制；生理病理过程的发生机理，疾病的发生与治疗；应用于生物乃至于非生物产业。 酶的化学组成：
（1）大多数是蛋白质(除小分子的有催化能力的RNA—核酶)
（2）一些酶的活性除肽链外不需要在酶的活性中心存在其他化学基团，称单纯酶
（3） 另一些需要附加的非肽链成分的辅助因子(结合酶)：如果辅助因子与酶疏松地结合，
这种辅助因子称为辅酶；如果辅助因子与酶紧密地结合，这种辅助因子称为辅基。
（4）许多酶可以结合调节因子或共价修饰：这些因子并非酶催化所必须，但可以调节酶活性；包括激素、第二信使、钙调蛋白等；共价修饰包括：磷酸化、糖基化等。
（5）许多酶可以由多个亚基构成：可以同聚蛋白，也可以是异聚蛋白；可以分为催化亚基和调节亚基。 酶活性的测定：
（1）酶活力与酶反应速度：
酶活力：指酶催化化学反应的能力，可以通过酶所催化的化学反应的速度来衡量。酶促反应
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