? 牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)，水解DNA 3?-磷酸酯键，产生5?-磷酸的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸
? 牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II)，水解DNA 5'-磷酸酯键，产生3?-磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个核苷酸 限制性内切酶：
? 可识别特异的碱基序列并将其水解断开，产物带5?-磷酸 基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶 ? 回文序列
? 粘性末端与平头末端 ? 限制性酶切图谱 常用核酸外切酶： ? 蛇毒磷酸二酯酶：水解3?-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的3?-磷脂键，产生5?-磷酸NMP ? 牛脾磷酸二酯酶：水解5?-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的5?-磷脂键，产生3?-磷酸NMP N-糖苷酶：水解碱基与核糖之间的糖苷键；产物为含氮碱基和无碱基末端的寡核苷酸 核苷酸酶：水解核苷酸的磷脂键；产物为核苷和磷酸 常用研究技术：
（1）核酸的分离纯化： 一般原则：条件温和，避免断裂；抑制核酸酶，避免降解；区分不同类型核酸。 （2）DNA的分离：
? 主要在于除去Pr、RNA
? 在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸、过碱、或机械振荡，可得高质量的DNA ? 真核生物染色体DNA与蛋白质的复合物(DNP)溶于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L的盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，DNA溶于水相
? 原核生物染色体DNA结合蛋白质较少，较易分离，用溶菌酶和SDS破碎细胞后，用氯仿异戊醇抽提Pr，再乙醇沉淀，重新溶解后用RNase除去RNA
? 质粒DNA为cccDNA，分子量较小，有超螺旋，因此密度和染色体DNA有明显的不同，可以用超离心分开
（3）RNA的分离纯化：RNA易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使RNase失活，在实验反应体系中要加RNase的抑制剂，常用皂土、二乙基焦碳酸、肝素、精胺。 目前常用的分离方法：
? 胍盐／氯化铯密度梯度离心(RNA密度>1.89，DNA密度约1.71，蛋白质密度<1.33)． ? 酸性胍盐／酚／氯仿法 常用分离纯化技术： （1）沉降分离
? 利用沉降速度和密度的不同分离核酸
? RNA常用蔗糖密度梯度、DNA常用CsCl密度梯度
? 沉降次序：RNA>闭环DNA>线状DNA>有开口的环状DNA ? 碱基组成对密度有影响
? 加入啡啶溴红染料，作为指示剂 （2）凝胶电泳
? 影响因素：胶浓度；核酸分子大小；核酸构象；碱基组成
? 电泳迁移率次序：超螺旋DNA>线状DNA>有开口的环状DNA
31
? RNA分离时，常加入蛋白质变性剂，如甲醛 ? 加入碱基染料作为指示剂
? 电泳后核酸可用于分子杂交，也可回收使用
? 琼脂糖凝胶电泳：孔隙大，支撑强度不高，适用水平电泳 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳：孔隙小，支撑强度高，适用垂直电泳 核酸序列的研究技术： 核酸的碱基顺序分析： （1）酶法分析：
? 1975，Sanger提出加减法，1977，提出了末端终止法
? 利用ddNTP在相应的位置终止体外复制DNA链的延伸，从而获得不同长度的具有特定碱基末端的核苷酸链，通过电泳分析，确定DNA的碱基序列 ? 反应系统：
? 模板链，引物，DNA聚合酶 ? 有同位素标记的4种核苷酸
? 分成四个反应组，分别加入对应ddNTP，比如T组加入ddTTP
? 当对应的ddNTP参入正在合成的核酸链时，合成在此处终止，形成不同长度的DNA片段
? 电泳将不同片段分开，读出DNA序列
? DNA自动分析仪
（2）分子杂交技术：定义：利用变性后复性过程中，不同来源的核酸分子可以形成杂合双链的特点，用人工合成的探针标记特定序列的核酸分子。 杂交技术
? 探针：人工合成的与目标核酸序列互补的小片段核酸序列，特异性的与目标核酸结合。带有标记物，可以用较简单的方法检测。
? 标记：放射性标记、酶标记、金属标记、抗原抗体标记（地高辛） ? Southern杂交：探针与DNA杂交 ? Northern杂交：探针与RNA杂交
? 原位杂交：在细胞内进行的杂交，可以实现对核酸的定位 （3）聚合酶链式反应技术（PCR）：DNA体外扩增技术，利用DNA聚合酶在体外以目标核酸链为模板聚合复制DNA，达到扩增目标基因的目的
原理：在有引物存在的前提下，DNA聚合酶以包含目的基因的DNA单链为模板，延伸引物链，形成DNA双链；DNA双链可以通过热变性拆分成单链，再与引物结合，作为模板继续复制DNA；通过上述过程的循环，可以实现目的基因的扩增。 反应体系：
? DNA聚合酶：使用热稳定的DNA聚合酶，如Taq ? 目标基因链：合适的长度
? 引物：人工合成的与目标基因链互补的小片段DNA，可根据需要，带上相应的标记物 ? 含四种核苷酸的缓冲液 反应流程：
? 热变性：常在95?C下进行，时间一般2min~5min ? 退火复性： 45~50?C，30~40S ? 酶促聚合反应：70~75 ?C，1~2min ? 重复上述步骤
PCR发展：自动PCR仪、RT-PCR、定量PCR
32