Ⅱ实验内容
实验一 蛋白质的沉淀与凝固
蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。
促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：
第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。
第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。
一、 蛋白质的盐析
[原理]
高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。
由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。 [操作]
1.取一试管，加入3ml 5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。
2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。） 3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是否复容。
二. 乙醇沉淀蛋白质
[原理]
乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。
1
用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。 [操作]
1. 取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作 试剂
5%蛋白质溶液（ml） 1%乙酸（滴） 95%乙醇（ml）
1 1 - -
2 1 1-2 -
3 1 - -
4 - - 2
2.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管变化并解释之。
三. 重金属盐沉淀蛋白
[原理]
在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。 [操作]
取试管4支，按下表操作。 试剂 （滴） 5%蛋白质溶液 1%乙酸 10g/L硫酸铜 30g/L硝酸银
1 5 - 3 -
2 5 - - 3
3 5 10 3 -
4 5 10 - 3
混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。
四. 生物碱试剂沉淀蛋白
[原理]
能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。
在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。
2
[操作]
取试管3支，按下表操作。 试 剂 5%蛋白质溶液（ml） 1%乙酸（滴） 苦味酸溶液（滴） 鞣酸溶液（滴） 三氯乙酸溶液（滴）
1 1 10 数滴 - -
2 1 10 - 数滴 -
3 1 10 - - 数滴
混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。
五. 蛋白质的加热凝固
[原理]
蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象。 [操作]
取试管4支，按下表操作 试 剂
5%蛋白质溶液（ml） 1%乙酸（滴） 10%乙酸（ml） 100g/LNaOH（ml）
1 2 - - -
2 2 1-2 - -
3 2 - 0.5 -
4 2 - - 0.5
混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。。另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？ [试剂]
1．5%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。 2．饱和硫酸铵溶液。 3．硫酸铵结晶粉末。 4．95%乙醇。
5．1%乙酸和10%乙酸。
3
6．30g/L硝酸银溶液。 7．10g/L硫酸铜溶液。 8．100g/L氢氧化钠溶液。
9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。 10．100g/L三氯乙酸溶液。
（李素婷）
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实验三 微量凯氏定氮法
[原理]
蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白质量。 [操作]
1．取血清或血浆0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）
2．取消化管1支，加入稀释血清0.5ml，50%硫酸0.5ml, 玻璃珠1枚，在电炉上消化。
3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，加3%H2O21~2滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至17.5ml，再加纳氏试剂至25ml，混匀，与标准管比色。
4．标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。
5．标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下
试 剂（ml） 标准硫酸铵应用液 18N H2SO4 蒸馏水
1 - 0.1 3.4
2 0.8 0.1 2.6
3 1.2 0.1 2.2
4 1.6 0.1 1.8
5 2.0 0.1 1.4
混匀，各管加奈氏试剂1.5 ml, 以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。
6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。 [计算]
蛋白质g %=含氮量?6.25?100 [试剂]
1．50%硫酸
2. 18N硫酸溶液：取比重1.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。 3. 3%H2O2 4. 0.9%NaCl 5. 奈氏试剂：
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