奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。
奈氏试剂应用液：取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。如浑浊，可静止过夜，取上请液备用。
6．硫酸胺标准贮存液：（1毫升=1毫克氮）
取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。
故：132.06﹕28=4.716﹕X X=1
即4.716克硫酸铵中含氮1克 7．硫酸铵标准应用液：
取硫酸铵标准贮存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸0.1毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存。
（周晓慧）
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实验四 双缩尿法测定蛋白质含量
[原理]
凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。 [操作]
1.标准曲线的制备
取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液
试 剂
标准蛋白溶液（10mg/ml） 生理盐水（ml） 双缩脲试剂(ml) 蛋白浓度(mg/ml)
1 0.0 1.0 4.0 0.0
2 0.1 0.9 4.0 0.2
3 0.3 0.7 4.0 0.6
4 0.5 0.5 4.0 1.0
5 0.7 0.3 4.0 1.4
6 0.9 0.1 4.0 1.8
混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2.样品测定
取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。
[试剂]
1．10g/L标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg /ml。
2．双缩尿试剂：称取CuSO4?5H2O 2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000 ml。 3.生理盐水
（周晓慧）
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实验五 改良酚试剂法测定蛋白质含量
[原理]
蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。
利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。 [操作]
（一）制作标准曲线
1．取试管6支分别编号，按下表加入试剂：
试 剂（ml） 标准蛋白溶液（1mg/ml） 生理盐水 试剂A
1 0.0 1.0 0.9
2 0.2 0.8 0.9
3 0.4 0.6 0.9
4 0.6 0.4 0.9
5 0.8 0.2 0.9
6 1.0 0.0 0.9
混匀后置于50?C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，各管加入试剂C 3ml，立即混匀，置37?C水浴箱恒温10分钟。冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。
2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。 （二）样品测定
取试管2支，按下表加入试剂
试 剂（ml）
稀释的待测样品 生理盐水 试剂A
测定管 1.0 - 0.9
空白管 - 1.0 0.9
混匀后在50?C水浴箱中保温10分钟，取出冷却后，两管各加试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，再各加试剂C 3ml，立即混匀，置37?C水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。 [结果与计算]
根据测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质含量。 [注意事项]
1.测定蛋白质的浓度应在0.015～0.110mg/ml范围。 2.各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊。
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[试剂]
1.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。
2．试剂A：2g酒石酸钾钠及100g Na2CO3溶于500ml 1mol/L NaOH中，用蒸馏水稀至1000ml。
3．试剂B：2g酒石酸钾钠及1g CuSO4?5H2O分别溶解于少量水中，混合后加蒸馏水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。 4．试剂C：
（1）市售的酚试剂，用1mol/L NaOH滴定相当于2.5 mol/L HCl，按1﹕10稀释即可。 （2）称取Na2WO4?2H2O 100g及Na2MoO4?2H2O 25g溶于700ml蒸馏水中，加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml混匀后，置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（Li2SO4?H2O）150g、蒸馏水50ml及浓溴水数滴，继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存，使用时稀释至1mol/L。
（周晓慧）
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实验六 紫外分光光度法测定蛋白质含量
[原理]
蛋白质在280nm处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量。对于同样浓度的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质时必须注意。若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。
蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在280nm处也有吸收，对此法有一定的影响。因此，一般情况下在测定A280的同时，测定A260，计算A280/A260 的比值。如果A280/A260≥1.5，可忽略不计核酸的影响，A280/A260<1.5时，需按下列公式计算蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 [操作]
1．标准曲线的制备： 取试管8支按下表加入试剂
试 剂（ml） 标准蛋白液（1mg/ml）
0.9%NaCl溶液 蛋白浓度(mg/ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 4.000 4.000 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.000 0.000 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.000
混匀，选波长280nm，用1cm石英比色杯，第一管为空白，分别测定各管溶液光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定：将待测的蛋白样品用0.9%NaCl溶液稀释，使其浓度在蛋白标准曲线范围之内，混匀后按上述方法测定光密度值，查标准曲线，得出样品的蛋白浓度。 [试剂]
1.标准蛋白液：准确称取结晶牛血清白蛋白 （精确0.001）用0.9% NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凯氏定氮法校正）。 2. 0.9% NaCl溶液。
（周晓慧）
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