实验七 凝胶过滤层析分离血红蛋白与硫酸铜
[原理]
血红蛋白（分子量64500）与铜溶液混合物，通过葡聚糖凝胶G-25层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，进行分离大分子的血红蛋白和小分子的硫酸铜。
[操作]
1．凝胶的准备：葡聚糖凝胶G-25 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸2小时（或在室温放置6小时），待冷却至室温时装柱。
2．装柱：在层析管底部填少许玻璃棉，关闭玻管的出口。然后自顶部缓缓加入葡聚糖凝胶G-25悬液。
待底部凝胶沉积1～2cm时，打开出口。当凝胶上升至距柱顶3cm时即可。 3．样品的制备：
（1） 血红蛋白的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，3000转/分离心5 分钟，弃去上清液，再用生理盐水洗血细胞两次。将血细胞用5倍体积蒸馏水稀释。
（2） 铜溶液的制备：将硫酸铜3.73g溶解于10ml热蒸馏水中，冷却后稀释到15ml。另取柠檬酸钠17.3g及碳酸钠（Na2CO3·H2O）10g，加水60ml，加热使之溶解，冷却后稀释到85ml。之后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中。
（3）取血红蛋白稀释液、铜溶液按2：3体积混合，作为样品。 4．加样：
（1）将层析柱出口打开，使床表面的蒸馏水流出，直到床面正好露出，再关闭出口。
（2）用小滴管将样品（约0.8ml）沿柱内壁缓缓地加于床面上，然后打开流出口，使样品进入床内，直到床面重新露出。
（3）用上述方法加入约2ml蒸馏水。当将近流干时，反复加入多量蒸馏水，进行洗脱，直至红蓝两条带分开为止。
[试剂]
1．葡聚糖凝胶G-25。 2．草酸钾。 3．生理盐水。 4．硫酸铜。 5．柠檬酸钠。
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6．碳酸钠。
（王鲁华）
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实验八 凝胶过滤层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
[原理]
本试验使用交联葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）将血红蛋白（红色，分子量为64500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白，从混合液中分开。由于它们的分子量及颜色的不同，可以观察到血红蛋白洗脱较快，而鱼精蛋白洗脱较慢。
[操作] 1．凝胶的制备
称取Sephadex G-50 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸1小时（此为加热法溶胀，如在室温溶胀，需浸泡3小时），取出冷却至室温后再行装柱。
2．装柱
取直径0.8～1.5cm，长度17～20cm的层析管，在底部填砂芯或少许玻璃棉，装上带有螺旋夹和细玻管的橡皮管，垂直置于铁架上，柱中先加入少量水，充满细玻璃管，并残留部分水于层析管下部，以排除层析柱底部及细玻管内的气泡。然后关闭玻管的出口，边轻轻搅拌以蒸馏水稀释的葡聚糖凝胶悬浮液，边将其自层析管顶部缓缓加入，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，一面继续加凝胶，待凝胶上升至距玻管顶3cm左右即可停止，最后以蒸馏水平衡凝胶柱。加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉，以免层析床分层，同时防止柱内有气泡。如层析床凝胶表面不平整，可在凝胶表面用细玻棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使表面平整。
3．样品的制备
（1）血红蛋白（Hb）溶液的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，以2500r/min离心5分钟，弃去上层血浆，用0.9％NaCl 5ml洗血细胞，重复三次，每次要把血球搅起，以3500r/min离心5分钟后尽量弃去上清液。加蒸馏水5ml，充分混匀，放冰箱过夜使沉淀的血球充分溶血，备用。
（2）DNP-鱼精蛋白的制备：称取鱼精蛋白0.15g，溶于10％NaHCO3溶液1.5ml中（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中，煮沸5分钟，冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸馏水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。
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（3）取血红蛋白稀释液0.1ml，加DNP-鱼精蛋白溶液0.2ml，充分混匀，此混合液即为样品溶液。
4．加样
加样时先将层析管出口打开，使床表面蒸馏水流出，直到床面正好露出，用下口较大的滴管，将上述样品（约0.3ml）缓缓沿层析柱内壁小心地加于床表面，注意尽量不使床面搅动，然后打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出，重复上法加1～2倍于样品体积的蒸馏水，这样可使样品的稀释最小，而样品又完全进入床内。当少量蒸馏水将近流干时，加入蒸馏水使其充满层析柱上面空间，开始洗脱。
5．洗脱与收集
反复加入蒸馏水洗脱，调节出口处螺旋夹，使洗脱速度在0.5～1.0ml／分左右（约10～15滴／分）洗脱时可观察到黄、红两条区带逐渐分开，当红色的血红蛋白区带到达玻管下端时，用带刻度的离心管收集流出液，直至红色液全部流出为止，待测。再换以另一离心管，收集黄色的DNP-鱼精蛋白洗脱液，直至黄色液全部洗出为止，此液可回收重新使用。
[结果与计算]
取一试管吸取前述血红蛋白液0.1ml，加蒸馏水至5ml作为标准管（上柱前液），取收集的血红蛋白液加蒸馏水至5ml。以蒸馏水为对照，测得标准管及收集管液体在540nm波长处的光密度值，按下列公式计算血红蛋白的回收率。
血红蛋白回收率（％）＝洗脱收集液光密度值／上柱前液光密度值 ×100％ [试剂]
1．Sephadex G-50 2．草酸钾抗凝血液 3．0.9％NaCl 4．鱼精蛋白 5．10％NaHCO3 6．2，4-二硝基氟苯 7．95％乙醇
（王鲁华）
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实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
[原理]
血浆中的各种蛋白质，它们的等电点都在pH7.0以下，如将它们置于pH8.6的缓冲液中电泳时，它们都解离成负离子，向正极移动。在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的数量不同以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，利用这种性质可以把各种蛋白质分开。
醋酸纤维薄膜作为电泳支持物具有电渗小、分离速度快，区带清晰、操作简便等优点。醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白及α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白γ-球蛋白等5条区带。固定染色之后，不仅可看到清晰的色带，并可将各带染料溶于碱溶液中进行定量测定，从而计算出血清中各种蛋白质的构成比。 [操作] 1．准备与点样：
（1）将薄膜切成2×8cm的小条，在薄膜无光泽面距—端1.5cm处用铅笔画一横线，表示点样位置。
（2）将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中(缓冲液盛于培养皿中)。 （3）将充分渗透(指膜上没有白色斑痕)的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线驾空。
(4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加样器的钢口蘸取样品，平直印于膜上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。
2．电泳：将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极。槽架上四层纱布怍桥垫，膜条与纱布需贴紧，待平衡5分钟后通电，调节电压至90V，或电流为0.4～0.6mA/cm宽，通电1小时左右关闭电源。
3．染色：通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，首先用自来水冲洗一下，然后立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景变白为止。用滤纸吸干薄膜。 4．定量：
（1）取试管6支，编好号码，分别加入0.4mol/L氢氧化钠4ml。
（2）剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪—平均六小的薄牵，分别浸入上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。
（3）约半小时后，用分光光度计进行比色，在650nm波长下读取各管的光密度，用空白薄膜条洗出液为空白对照。
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