上清液。
8．拜耳（Bial）氏试剂 称取1.5g3，5-二羟甲苯，加入浓盐酸500ml，再加10%氯化高铁20至30滴。临用前配制，冰箱保存。
9．二苯胺试剂 取二苯胺1g溶于100ml冰乙酸（A.R.），加入2.75ml浓硫酸。临用前配制，储于棕色瓶中。
（王鲁华）
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实验十三 动物组织中DNA的提取
[原理]
动物组织中的基因DNA均以脱氧核糖核蛋白的形式存在。在浓氯化钠（1～2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，而核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（0.14mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，而核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS处理，使DNA与蛋白质分开，再用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于上层水相中，加入适量的95%乙醇，DNA钠盐即沉淀析出。为防止DNA酶解，提取时应加入EDTA二钠（乙二胺四乙酸）。
得到的样品中DNA含量可用二苯胺法定量测定。DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中转变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，可用比色法测定。
[操作]
1.DNA的分离纯化：
（1）将10只小白鼠迅速杀死，取出肝脏，用0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液洗去血液，剪碎，加入50ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液，置于匀浆器中研磨，待成糊状后，将糊状物离心10分钟（4000r/min）弃去上清液，沉淀用0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液洗二三次。即重复加入50ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液，搅匀，离心。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
（2）向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液，使总体积为44ml，然后滴加25% SDS溶液3ml，边加边搅拌。加毕，置60C水浴中保温10分钟（不停搅拌），溶液变得粘稠并且略透明，取出冷至室温。此步骤使核酸与蛋白质分离。 （3）加入5mol/L NaCl溶液10ml，使NaCl最终浓度为1mol/L，搅拌10分钟，加入约一倍体积氯仿-异丙醇混合液，振摇20分钟，离心10分钟（4000r/min）。沉淀与下层液弃去，取上层液加入1.5倍体积95%乙醇，边加边用玻棒搅拌，DNA丝状物即
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缠在玻棒上。
（4）将DNA粗品置于27ml 0.015mol/L NaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml 1.5mol/L NaCl-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液，搅匀。待丝状DNA重新溶解后，加入一倍体积氯仿-异丙醇混合液，振摇10分钟，离心（4000r/min）10分钟。可用氯仿-异丙醇反复抽提，直至界面处不再出现蛋白质凝胶为止。取出上层液加入1.5倍体积的95%乙醇，边加边搅拌，DNA丝状物即缠在玻棒上。
（5）取出丝状DNA，依次用80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。留待定量测定。
2．鉴定
（1）标准曲线的绘制：
取干试管6支，编号，按下表加入试剂： 试 剂（ml） DNA标准液（50μg/ml） 0.5mol/L过氯酸 二苯胺试剂
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0 0 1.0 2.0
1 0.2 0.8 2.0
2 0.4 0.6 2.0
3 0.6 0.4 2.0
4 0.8 0.2 2.0
5 1.0 0.0 2.0
混匀，60C恒温水浴中放置1小时。冷却后，于600nm波长处进行比色。以各管光密度为纵坐标，DNA含量为横坐标作图。
（2）样液测定：称取干燥的样品DNA 5mg溶于5ml 5mmol/L NaCl 溶液中，再按标准DNA溶液同法处理。然后，取1.0ml样液，加二苯胺试剂2.0ml，置60C恒温水浴1小时，测定光密度。对照标准曲线求得DNA量。
[结果与计算]
按下式计算样品中DNA的百分含量：
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[注意事项]
1．本实验也可用新鲜兔肝10g进行DNA的提取，本法提取的DNA已有一定程度的解聚。
2．其它糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对二苯胺显色反应有干扰，
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测定前应尽量除去。
3．样液中DNA含量应控制在50μg/ml左右。 4．如无匀浆器，可用研钵研磨破碎组织。 [试剂]
1．5 mol/L NaCl溶液：将29.23g NaCl溶于蒸馏水，稀释至100ml。
2． 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液：溶8.18g NaCl及55.83g EDTA二钠于蒸馏水，稀释至1000ml。
3．25% SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100ml 45% 乙醇。 4．氯仿-异丙醇混合液：氯仿：异丙醇=24﹕1（V/V）
5．1.5mol/L NaCl-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠8.77g及柠檬酸三钠4.41g溶于蒸馏水，稀释至100ml。
6．0.015mol/L NaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液：取10ml试剂5，稀释至1000ml。 7．80%乙醇。 8．95%乙醇。 9．无水乙醇。 10．二苯胺试剂：
A液：二苯胺（如不纯，需在10%乙醇中重结晶2次）1.5g，溶于100ml冰乙酸（A．R．），再加浓硫酸1.5ml，贮于棕色瓶。
B液：16mg乙醛溶于1.0ml蒸馏水，随用随配。 临用时，将20ml A液与0.1ml B液混合即得。
11．1mol/L过氯酸溶液：将10ml 过氯酸（70%）用蒸馏水稀释至110ml。 12．0.5mol/L过氯酸溶液：取50ml 1mol/L过氯酸，用蒸馏水稀释至100ml。 13．5mmol/L NaOH溶液：NaOH 0.02g溶于蒸馏水，稀释至100ml。
14．标准DNA母液：准确称取DNA5mg，溶于5ml 5mmol/L NaOH溶液中。4C可保存6个月。
15．标准DNA溶液：吸取母液1.0ml加上1mol/L过氯酸1.0ml，70C保温10分钟，冷却，离心（4000r/min），取1.0ml上清液，用0.5mol/L过氯酸稀释10倍，即得50μg/ml DNA标准溶液。
（王鲁华）
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实验十四 动物组织中核酸含量的测定
核酸分子中含有戊糖、磷酸和含氮碱。一般测定核酸的方法，是测定三者中的任何一种成分即可计算核酸的含量。下面分别介绍测磷法、测糖法和紫外吸收法。 一、测磷法 [原理]
核酸的量可以用核酸的磷含量（RNA-P，DNA-P）来表示。纯的核酸含磷量为9%（RNA的磷含量为8.5～9.0%；DNA的磷含量为9.2%）。测得了核酸中磷的含量，即可求出核酸的含量。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，再被还原剂还原成钼蓝，用比色测定。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，以此为定量依据。 样品中如有无机磷，应减去。
[操作]
1．磷标准曲线的绘制：取试管7支，按下表操作。 试剂（ml） 磷标准溶液（5μg/ml） 蒸馏水 定磷试剂 磷含量（μg）
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1 0 3 3 0
2 0.5 2.5 3 2.5
3 1.0 2.0 3 5.0
4 1.5 1.5 3 7.5
5 2.0 1.0 3 10
6 2.5 0.5 3 12.5
7 3.0 0 3 15
混匀，于45C水浴中保温20分钟，冷却，在660nm波长下测定各管光密度。以磷含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制出磷标准曲线。
2．核酸中总磷量的测定：取1ml被测样品液（约含2.5～5mg核酸，也可取固体样品）置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色或淡蓝色为止，稍冷却，加1ml水，于100C加热10分钟，使焦磷酸转变为磷酸。冷至室温，用蒸馏水定容到50ml。与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其它完全相同。
取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml，摇匀，45C放置20分钟，于660nm
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