绪论
1生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。
2生物技术的内涵主要：运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。
3主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、发酵工程、生物化学工程、蛋白质工程、代谢工程。
4细胞工程的概念：指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
5动物细胞与植物细胞培养的不同：①能进行离体培养的材料范围不同，全能性体现上差别。 ②所需要的培养条件不同。光照、营养③生长形式不同。 6动物细胞工程的研究范畴：动物细胞培养、动物细胞融合、干细胞和组织工程、胚胎工程、克隆技术、动物生物反应器、染色体工程、低温冷冻技术 7植物细胞工程的研究范畴：植物组织培养技术、细胞培养技术、原生质体融合与培养技术、染色体工程、低温冷冻技术、转基因植物。
第二章
1.污染对培养细胞的影响及污染的检测:1）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测:取10ml 细胞悬液离心1000 转5 分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。2)真菌污染对细胞的影响及污染物的检测:污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。3）支原体和病毒污染对细胞影响及污染物的检测:支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存;支原体污染的检测:①相差显微镜观察支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。②低涨处理地衣红染色观察取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。③荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。④电镜检测若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。4）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测:这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。 2.污染的预防 : (1)添加抗生素 (2)从物品、用品消毒灭菌着手:1）细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。 2）操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。(3)从操作者做起:①进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。②操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。③操作时要常更换吸管(4)防止细胞交叉污染:1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。3）细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。 (5)无菌室的彻底消毒:1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室;2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
3.污染的排除:1）抗生素排除法:一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，可采用5－10 倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24－48 小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。2）加温除菌:根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41 度中作用5－10 小时（最长可以达18 小时）杀灭支原体。3）动物体内接种:受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。4)与巨噬细胞共培养 :在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7－10 天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。 第三章
4动物细胞培养:定义：模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。 应用领域：生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用蛋白;种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子细胞。基础研究的细胞材料：细胞模型。
5培养细胞发生变化：失去原有组织结构和细胞形态；分化现象减弱或出现类似“反祖”(Atavism)现象；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡，或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
6微生物和动物细胞培养方法的比较： pH控制 搅拌速度 溶氧控制 培养基灭菌方法 培养时间 对水纯度的要求 微生物细胞 添加酸、碱 速度快、范围广 改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度 高温蒸煮 几小时—几天 较低 动物细胞 CO2-HCO3缓冲液 较慢 改变进入气体的氧浓度 过滤 几天—3、4周 很高 7培养动物细胞与微生物细胞比较：细胞生长缓慢；细胞大，无细胞壁，机械强度低；营养要求高，对环境敏感；群体生长效应，细胞间主要以聚集体形式存在培养过程产品分布细胞内，成本高；原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡。
8离体培养的动物细胞可分为三类：贴壁依赖型（细胞贴附包括细胞与细胞之间的接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式。细胞在体内、外的粘附方式存在差异：体内：粘附是全方位,外形具有复杂的立体特征；体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同；贴壁非依赖型；兼性贴壁细胞。
9、贴壁依赖性细胞，根据形态大致分成以下四型：成纤维细胞型、游走细胞型、上皮型细胞、多型细胞型
10、每代贴附生长细胞的生长过程
游离期此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟~4小时。
贴壁期细胞株平均在10分钟~ 4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 潜伏期细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜
影响游离期、贴壁期、潜伏期因素： 1）细胞种类 2）细胞密度 3）培养条件等因素有关 4）细胞机能状态 对数生长期
停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂；机制：接触抑制、密度抑制。
11、细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制
但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。 12、贴壁培养的优点：
●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。 ●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。●适用于所有类型细胞。 贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比
●扩大培养比较困难，投资大；●占地面积大；●不能有效监测细胞的生长； 13、悬浮型
某些类型的癌细胞、淋巴细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。
优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞) 思考题：
1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给
2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？
提示：无菌、无毒的环境。适宜的温度、适宜的pH和气体环境。
第二节动物细胞培养的环境与营养要求 一、 动物细胞的营养需求
1、 天然细胞培养基（血清、胚胎浸出液、胚胎浸出液、水解乳蛋白、鼠尾胶原、血浆）
血清的主要成分及作用
提供基本营养物质;提供激素和各种生长因子;提供结合蛋白;提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤;对培养中的细胞起到某些保护作用 细胞培养中使用血清的缺点
（1）血清不是它们接触的生理学液体
（2）血清含一些对细胞产生毒性的物质，如补体、抗体、细菌毒素，多胺氧化酶
（3）血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致，血清的使用使得实验和生产的标准化困难。
（4）取材中可能带入支原体、病毒
（5）大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。 2. 合成细胞培养基 3.干粉培养基的配制 注意以下问题： ●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、HEPES 等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 ●配制是要保证充分溶解●配制所用的水应是三蒸水●所用器皿应严格消毒。 ●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4 度。 4 .无血清技术及其培养基
基本成分为基础培养基及添加组分两大部分(1）促贴壁物质 (2）促生长因子及激素 (3）酶抑制剂 (4）结合蛋白和转运蛋白(5)微量元素
为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：●处于对数生长中期●>90% 活细胞率●适应时以较高的起始细胞接种
使用无血清培养基的优点：●增加确定性●性能更加一致●容易进行纯化和下游加工
●细胞功能的精确评估●增强生长或产量●生理反应性的较好对照●增强细胞内中介物的检测 缺点：表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便 5.无蛋白培养基
6. 限定化学成分培养基
7.其他细胞培养用液1）平衡盐溶液2）抗生素（常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”） 二、动物细胞培养的环境要求1、无污染环境（培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件）2、温度（维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。）3、溶氧及气体环境（所需气体主要有氧气和二氧化碳）4、 pH （pH值约在7.2~7.4pH 调整液常用的NaHCO3 溶液）5、渗透压 第三节细胞培养的基本方法
1、体外培养的生物成分无外乎三种结构形式：
其一是器官培养，保持活力和功能。其二小块组织或称为组织块，一般称为外植块； 其三是将生物组织分散后制成的单个细胞，一般称为分离的细胞或者分散的细胞。 2、细胞培养狭义主要是指分离（散）细胞培养。广义包括单（个）细胞培养 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone） 一、动物细胞培养的基本阶段
1、原代培养特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。
2、传代期特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型 3、衰退期特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。 二、培养步骤 1、准备工作2、取材 3、细胞分离技术
消化法( 1) 胰酶消化法( 2 )胶原酶消化法( 3) EDTA消化法 机械法（1）离心分离法（2）机械解离法
三、培养方法1）悬滴培养法2）培养瓶培养方法3）旋转管培养法4）灌注小室培养法5）、培养板培养法
四、细胞克隆培养技术 1.）稀释铺板法 2.）饲养层克隆（饲养细胞：是一层经过射线照射或丝裂霉素C作用或失去分裂能力，供其他细胞附着的细胞层）3.）基质附着 4.）琼脂克隆
五、克隆细胞的传代分离1.克隆化环分离： 2.射线照射分离法：3. 半固体培养基细胞克隆分离
六、传代培养
1、贴壁生长细胞传代（采用酶消化法传代。）2、悬浮生长细胞传代（离心法传代、直接传代法）3、半悬浮生长细胞传代（此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。） 七、细胞培养中应注意的几个问题
1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。
2）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。
3）深度：需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的在深的培养液（5mm）中生长较好。 4）去除死细胞
第四节细胞系或细胞株建立
一、体外培养细胞的种类和命名
细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的一群不均一细胞，即称之为细胞系。 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞 无限细胞系有的只有永生性,但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；
克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。
培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同(2n细胞占75＞或80％以上)的细胞群，称二倍体细胞培养。
二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。 肿瘤细胞系或株是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。
二、建立细胞系（或株）的要求
1、组织来源2 、细胞生物学检测 3、培养条件和方法 第五节动物细胞大规模培养技术
动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器