中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
一、应用方面1.疫苗制备2.单克隆抗体制备 3.病毒研究4.毒性检测实验5.疾病诊断、治疗 二、悬浮培养（主要用于非贴壁依赖型细胞培养。） 三、固定化培养方法
固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。 常用固定化方法, 如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。 1. 吸附
1）微载体微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。 一种理想的细胞支持物应该具备以下几个特征：（1)生物相容性。 (2)简便的无毒害固定化过程 (3)良好的传质特性 (4)良好的机械稳定性 (5)最大的比表面积 (6)适合细胞生长的形状和大小。 (7)粒径分布均一 (8)能高压灭菌 (9)可重复利用，易于清洗 (10)能保护细胞免受机械损伤(11)接种方便。 (12)能固定大部分细胞 (13)适合大规模培养 (14)易使细胞、载体与培养基分离(15)适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。
搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。
微载体培养优点:①比表面积大, 单位体积培养液的细胞产率高; ②采用均匀悬浮培养, 无营养物或产物梯度;③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况; ④细胞收获过程相对简单, 劳动强度小; ⑤培养基利用率高, 占地面积小; ⑥放大容易
缺点：搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高，微载体吸附力弱。 2 ）多孔微载体多孔微载体将细胞固定在孔内生长, 具有一系列优点:
①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍; ②细胞在孔内生长, 受到保护, 剪切损伤小; ③与包埋法相比, 传质尤其是传氧效果好 ; ④两种类型细胞都适用; ⑤细胞三维生长, 细胞密度是实心微载体的10 倍以上, 有的可达108 个/ mL; ⑥适用于长期维持培养,细胞生长情况依然良好; ⑦微载体浓度高, 实心载体在培养液中浓度增大到一定时, 细胞密度反而下降; 而大孔微载体在浓度较高时, 表面碰撞增加, 能促使细胞在孔内生长;⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。 2 .包埋
将动物细胞包埋在各种多聚物中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。
此法步骤简便, 条件温和, 负荷量大, 细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护, 细胞能抗机械剪切。
缺点, 如扩散限制, 并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。 包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。
多孔凝胶是最常用的载体, 用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。
1）海藻酸钙凝胶原理：使海藻酸钠中的Na+部分被部分被Ca2+(或Al3+等)取代而形成多价离子交联的离子网络凝胶,因此,这种方法又交联的离子网络凝胶,因此,这种方法称离子变换凝胶法
2）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶无毒性, 具有较大的空隙, 可以允许大分子物质自由扩散, 因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。）
3）血纤维蛋白（血纤维蛋白可以促进细胞贴壁, 因此两种类型的细胞都适于培养。而且基质高度多孔, 允许大分子物质的自由扩散。但机械强度差, 对剪切力很敏感。）
3 .中空纤维:中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态, 利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入, 使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵塞, 观察困难, 细胞生长或过量气体产生会破坏纤维。 4 微囊化
优点①可防止细胞在培养过程中受到物理损伤; ②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从而提高细胞密度和产物含量, 并方便分离纯化处理。
缺点①微囊制作复杂, 成功率不高; ②微囊内死亡的细胞会污染正常产物; ③收集产物必须破壁, 不能实现生产连续化。 三、动物细胞培养方式1.分批培养（悬浮培养） 2.流加培养 3.连续培养 4.连续灌注培养（与3的区别在于无细胞流出）（固定化培养） 四、动物细胞培养生物反应器
具备低的剪切效应、较好的传递效果和流体力学性质、空间利用率高、无菌、易控制及检测是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。
1 .搅拌式生物反应器2 中空纤维反应器 3. 气升式生物反应器（实现动物细胞高密度培养的常用设备之一, 其特点是结构简单, 操作方便。） 优点:与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。
第六节细胞冻存和复苏
冷冻保存：就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70度的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。
一、在冷冻过程中，细胞会受到两方面的损害
1、快速冷冻时，细胞内形成的冰晶，对细胞膜和内部结构产生机械性损害，这是指冷冻的物理损伤。
2、当缓慢降温时，细胞内的水，有足够的时间完全渗到外面，从冰点缓慢降到细胞完全脱水，往往需要几个小时或更长时间，细胞一直处于高浓度溶质中。如不加抗冷冻剂，细胞也会受到损害，这是冷冻的化学损伤。 二、冰冻保护剂
渗透型冰冻保护剂：多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。（常用的渗透型冰冻保护剂有甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。） 非渗透型冰冻保护剂：能溶于水，但不能进入细胞， 非渗透型冰冻保护剂：主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、葡聚糖（右旋糖酐）、聚乙二醇（PEG）、白蛋白、羟乙基淀粉（HES）等
三、冷冻保存方法1. 非玻璃化冷冻－－－－－慢速冷冻2.玻璃化冻存 四、细胞复苏方法（非玻璃化冷冻）
（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37-38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
第四章（干细胞和组织工程)
1、干细胞的概念及特征
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
干细胞的几个主要特征:（1）形态特征—圆形或椭圆形，核质比大；（2）生化特征—较高的端粒酶活性。（3）增殖特征 干细胞能无限增殖分裂；属非终未分化细胞，终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记；增殖的缓慢性与自稳性，在机体的数目、位置相对恒定；干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂，另一种是非对称分裂方式。 2、干细胞的分类
按分化潜能大小来分类:
全能干细胞（Totipotent stem cell ）：它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。
多能干细胞（pluripotent stem cell ）：具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞。
专能干细胞（multipotent stem cell ），等。这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞 根据干细胞组织发生的名称进行分类
胚胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞 根据来源来分
来源于胚胎--- 胚胎干细胞ESC（Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC（Embryonic Germ Cell ） 畸胎瘤干细胞 ECC（embryonal carcinoma cells）
来源于成体--- 成体组织来源的干细胞ASC（Adult-derived Stem Cell ） 3、胚胎干细胞的分离
（1）早期胚胎的选择不同动物甚至同种动物不同品系间的胚胎，在发育速度等方面存在着差异。因而不同动物分离ES细胞用不同发育阶段的胚胎效果不同。
一般确定胚胎时主要考虑：①细胞要具有全能性；②细胞数量充足；③在体外培养过程中具有增殖能力；④在培养过程中能维持细胞多能性。
（2）胚胎干细胞的分离方法目前胚胎干细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞团和生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常用。1)免疫标记及外科方法 2)显微外科学方法 3)组织培养法
（3）人类胚胎干细胞的来源
? 人工流产后的人类胎儿生殖组织。
? 通过体外授精产生的人类胚胎，治疗不育症的夫妇不再需要。
? 用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎。女性供卵要非常慎重。 ? 通过体细胞核转移技术(克隆技术)产生的人类胚胎。 4、胚胎干细胞系的培养
（1）.培养基与消化液培养基：高糖、谷氨酰胺、胎牛血清 15% 、抑制分化因子
消化液：高浓度胰蛋白酶 EDTA （2）饲养层培养饲养细胞：成纤维细胞、输卵管上皮细胞、子宫上皮细胞、胎儿睾丸细胞。常用的饲养层细胞有3种，小鼠胎儿成纤维细胞(STO)、原代小鼠胎儿成纤维细胞(PMEF)和同源胎儿成纤维细胞(HEF)。饲养层细胞的作用：促进全能性(或多能性)细胞的增殖，分泌成纤维细胞生长因子等促有丝分裂因子，抑制其分化，分泌LIF等细胞分化抑制因子。
（3）条件培养使用条件培养基具有消除饲养层细胞干扰、免受致癌剂丝裂霉素C影响、操作简便等优点，可以进一步分析ES细胞分化的启动和关闭机制。
（4）外源性分化抑制因子 ES细胞的分化抑制是多种因子共同作用的结果，其中起主导作用的是分化抑制因子(LIF／DIA)。 5、组织工程
组织工程是指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机制，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。
基本原理和方法：将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损部位，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
组织工程的三要素：细胞、支架、信号A、细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞（胚胎干细胞、成体干细胞）B、组织生长支架需求：（1）生物相容性好（2）生物亲和性表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长（3）生物可降解性降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。（4）三维内部连通孔隙（5）具备支架强度。（组织工程所应用的材料：天然：采用胶原制作人工皮和血管的模型 ;人工：聚乳酸、聚羟基乙酸、两者的共聚物（PGA-PLA）、聚ρ-羟基丁酯（PHB）；聚乳酸-已内酯的共聚物（PLC）、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐 ;天然高分子同合成高分子的复合物，如胶原-PCA的复合物等;有机材料同无机材料的复合物，如羟基磷灰石-甲壳素的复合物，羟基磷灰石-PLA的复合物等。C、生长因子表皮生长因子：是对上皮细胞增殖有很强促进作用的53个氨基酸残基的多肽。神经生长因子：为神经细胞特异性分泌的营养蛋白。肝细胞生长因子：为728个氨基酸残基单链组成。骨形态发生蛋白：能诱导或刺激新骨的生成。 6、组织工程的技术路线
（1）体外得到工程化组织、移植——目前主要的方式（2）细胞与支架前体混合注射体内，原位形成凝胶支架，提供新组织形成的空间 7、组织工程的应用 （1）皮肤修复;
（2）骨修复：构建组织工程骨的方式：①支架材料与成骨细胞；②支架材料与生长因子；③支架材料与成骨细胞加生长因子。生长因子通过调节细胞增殖、分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程
第五章动物胚胎工程
1、胚胎移植的概念（embryo transfer) 也称受精卵移植，是指一头母畜（称为“供体”）发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的输卵管或子宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。
2、胚胎移植的生理基础及原则 （1）胚胎移植的生理学基础：
? 成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发
育和排卵数可达十数个
? 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 ? 早期胚胎处于游离状态 ? 胚胎发育不存在免疫问题
? 胚胎的遗传性不受受体的影响 （2）胚胎移植的基本原则
? 胚胎移植前后所处的环境的同一性
– 供体和受体在分类学上的相同属性
– 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性 – 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性
? 胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内
? 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响 3、胚胎移植的技术程序 （1）供体和受体的选择
? 供体应具有相当高的育种价值
? 供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健 ? 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种 ? 受体健康状况良好，已进入发情季节 ? 供受体发情时间应接近或一致 （2）超数排卵处理
? 意义：让每个供体提供更多的胚胎
? 处理时间：牛：预计自然发情时间的前4天，或发情周期的第9-10天;羊：发情周期
的第12-15天，促性腺激素（FSH）处理的第二天或第三天，注射PG（前列腺素）
（3）供体母畜的配种
? 必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束 ? 配种前应对种公畜的精液进行质量检查可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，
以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精
（4）胚胎的收集
? 胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液 ? 手术法收集胚胎
– 输卵管冲胚(2-3d)：顺向冲胚、逆向冲胚 – 子宫角冲胚(6-7.5d)
? 非手术法收集胚胎二路法三路法 （5）胚胎的检查
? 收集到的冲洗液静置，冲洗液分离 ? 拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中
? 胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级
别
（6）胚胎的保存
（7）供体牛、受体牛的同期发情 （8）胚胎移植
（9）供体和受体的术后观察及处理 4、胚胎移植的应用范围
在家畜改良方面的应用；在特定品种扩繁上的应用；在动物生物多样性上的应用；其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精。 5、胚胎分割
（1）概念:采用显微手术（机械方法）的方法将早期胚胎分割成2分胚,4分胚或8分胚,经体内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎或同卵多胎的技术。