细胞工程(整理)(5)

2020-04-17 06:09

1、可以利用发酵工程技术大规模生产; 2、胞外活性物质制备容易 缺点:

1、真核生物基因不能表达或者没活性

2、细菌发酵形成包涵体,使下游加工成本增加 第二代细胞生物反应器 缺点:生产成本高 第三代动物植物反应器

优点:可大规模种植或养殖,通过乳腺、血液等制备活性物质简单易行 缺点:植物种植受环境、季节影响转基因动植物制备成本昂贵转基因动物易产生一些伦理问题

一、动物生物反应器

一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器 1、动物血液生物反应器

外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器 2、动物膀胱生物反应器

外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器 3、动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物, 指导外源基因在乳腺中表达, 并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。 二、动物乳腺生物反应器

1. 动物乳腺生物反应器的制备 (1)表达载体的构建

目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件,主要有四类乳腺定位表达调控元件:第一类是B2乳球蛋白(BL G),第二类是酪蛋白基因调控序列:第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列;第四类是乳清白蛋白基因调控序列 (2)目的基因的选择

选择目的基因的基本要求是,正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。 (3)体外重组

选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组,构建融合基因。 (4)基因转导

将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。 (5)胚胎移植

利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内,生产转基因动物,得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。 (6)鉴定

转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定 2. 动物乳腺生物反应器的优点 ?产品质量稳定、产品成本低、研制开发周期短、无污染、经济效益显 3. 动物乳腺生物反应器的应用 ?提高乳汁营养价值、生产药用蛋白 4. 动物乳腺生物反应器存在的问题

(1)外源基因在动物体内的位点整合问题(2)乳蛋白基因表达组织特异性问题(3)目的

蛋白的翻译后修饰问题(4)转基因表达产物的分离和纯化问题(5)转基因的技术与方法问题(6)伦理道德问题

Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子,长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段,当农杆菌侵染寄主细胞后,T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。Ti质粒的这一特性为农杆介导法植物转基因奠定了基础 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体,存在如下障碍:

①Ti质粒分子量过大,一般在160~240kb,比pBR322质粒大50倍左右; ②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点,不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因;

③T-DNA区内含有许多编码基因,其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡,转化细胞长成肿瘤,阻碍细胞的分化和植株的再生;

④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒,也只能在农杆菌中进行扩增; ⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。

根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同,Ti质粒可以被分成四种类型: 章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型(agropine)农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型

Ti 质粒的改造除去T-DNA上的生长素(tms)和分裂素(tmr)生物合成基因,因为生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物;除去T-DNA上的有机碱生物合成基因(tmt);因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸,影响植物细胞的生长;除去Ti 质粒上的其它非必需序列,最大限度地缩短载体的长度安装大肠杆菌复制子,使其能在大肠杆菌中复制,以利于克隆操作;安装植物细胞的筛选标记,如neor基因,使用植物基因的启动子和polyA化信号序列;neo 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。


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