过程。
2.细胞融合研究的发展历史
Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。
Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。
1958年日本学者冈田（Okada）发现日本血凝性病毒发现日本血凝性病毒（仙台病毒）具有触发动物细胞具有触发动物细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者高国楠创年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEEG）化学融合法。开拓了植物细胞融合的研究。
1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20世纪80年代出现了电融合技术。
3.细胞融合的意义:a细胞融合打破有性杂交过程中的种间隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径.b创造细胞质杂种创造细胞质杂种。 第二节细胞融合的基本步骤细胞融合的基本步骤
1.细胞融合的常用方法:a生物法-仙台病毒法b化学法-PEG c物理法-电融合诱导法电融合诱导法
2.根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其可将其分为以下几种类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。
多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。
3. 常用的融合细胞筛选标记:a基于药物抗性所建立的杂种筛选b基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选c由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选d具有所需性状杂种细胞的筛选e荧光标记
4.常用的融合细胞筛选方法
1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷亲本的缺陷,令杂种细胞表现正常。 如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型亲本
两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长
2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。 如:亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长
3）利用生长特性筛选法：利用原生质对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 ?例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。
4）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有氨苄青霉素抗性但只能在 37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗氨苄青霉素。 杂种细胞能在高温和含氨苄青霉素的培养基上生长。
5）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。
亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体
在荧光显微镜下，亲本1为白色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分 第三节动物细胞融合与单克隆抗体
1.单克隆抗体:只针对某只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
多克隆抗体缺点：特异性差、效价低、数量有限、动物间个体差异大动物间个体差异大，难以重复制备难以重复制备
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。 2.杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备
（一）骨髓瘤细胞的选择:次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT —）
胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK —）
（二）免疫小鼠并制备免疫细胞悬液
(1)用特异性抗原免疫小鼠，使其脾脏内产生大量处于活跃增殖状态的特异B淋巴细胞。 (2)颈椎脱臼法处死小鼠颈椎脱臼法处死小鼠，，无菌条件下取出脾脏无菌条件下取出脾脏；； (3) 剃除结缔组织和脂肪，撕开脾包膜；
(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯将脾淋巴细胞轻轻挤到培养液中，经悬浮和沉淀后，制备细胞悬液。
（三）细胞融合细胞融合
（1）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余
上清。
（2）加入40-50%的PEG，静置。
（3）加培养液终止PEG的作用，离心，弃去上清液。
（4）用HAT培养液悬浮细胞，加到96孔板内，55％CO 恒温箱中37℃培养。 （5）每隔33天更换1/2HAT培养液。。
（6）融合细胞一般3-6天开始形成克隆，而其余细胞逐渐死亡。
（四）抗体检测和杂交瘤细胞的筛选:a联免疫吸附测定法(ELISA) b免疫荧光法（IFA）c放射免疫法(RIA)
3.单克隆抗体的大量制备
体内法: 需要大量活的小鼠而不适合规模化生产，腹水中可能混有小鼠本身的其他抗体，不利于抗体的纯化和临床应用
培养法：产量低，大量生产费用较高 第四节植物细胞融合与原生质体培养
1.原生质体的制备:a基础材料准备基础材料准备 b预处理与酶解 c原生质体收集与纯化原生质体收集与纯化 d原生质体活力测定
2.预处理与酶解:预处理往往有助于获得优质的原生质体。
可能的机理：a改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度；b改变细胞壁的化学成分或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。 预处理方法：a暗处理-豌豆枝条在暗室预培养豌豆枝条在暗室预培养1-2天，，可提高原生质体存活率 b预培养-将羽衣甘蓝叶撕去下表皮，置于诱导愈伤组织培养基上预培养上7天，
可显著提高分裂频率。c预萎焉-将叶片置于日光或日光灯下2-8h使叶片稍萎焉，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分离原生质体。d预质壁分离-可加快原生质体释放，提高原生质体的活力。
使用原则:以用最少的酶制剂品种、最少的量能分离得到完整、健康的原生质体为准。有时要在使用之前对酶纯化。
酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 3.酶处理：
两步分离法：果胶酶纤维素酶一步分离法（直接法）：混合酶液 酶浓度：材料和酶液体积比1:10 酶解时间酶解温度：25-30℃ 4.原生质体的收集和纯化
过滤-离心法：40-100的网筛过滤除去未消化的细胞（团）、碎片，在低速离心使原生质体沉淀离心使原生质体沉淀，细胞碎片留在上清液中细胞碎片留在上清液中，反复3-4次。 飘浮法：原生质体比重较小，能在具有一定渗透压的溶液中悬浮，然后用吸管收集。常用的飘浮剂：蔗糖、Percoll、Ficoll。优点-原生质体纯净，缺点-丢失较多。 沉降-漂浮法：：酶解液低速离心，收集沉淀重新悬浮离心，吸取表层的原生质体，并重新悬浮在洗涤液中，离心，收集沉于底部的原生质体。 5.原生质体活力检测
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光，由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。有活力的原生质体产生荧光，反之无荧光。
伊文思蓝法：伊文思兰不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。蓝色的是死原生质体，活原生质体不着色。 6.影响原生质体活力的因素 a分离材料的生理状态
b 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶 c溶液的渗透压
d分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 e环境条件：：操作环境的温度操作环境的温度、分离用具的影响分离用具的影响 7.原生质体培养基
无机盐：大量元素浓度；NO3 和NH4的比例；Ca2+浓度
有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 激素：常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D
渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗 8.原生质体培养方法
a液体浅层培养 :将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。 优点:操作简单，，对原生质体的损伤小，，且易于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
b液体－固体双层培养固体双层培养: 在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再 将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培固体培养基中的营养物质可缓慢释放到
液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。
c固体平板培养:即琼脂糖包埋培养即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约低融点的琼脂糖可在约30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。 优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率统计原生质体分裂频率。
缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
d琼脂糖珠培养 :将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。
9.原生质体发育和植株再生
a细胞壁的再生:原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。
b 细胞分裂和生长:一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料原生质体的材料、原生质体的质量原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异成分和培养条件而异。 c愈伤组织形成 :通常原生质体培养22周后周后，，形成多细胞的细胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞团，约6周后形成直径1mm的小愈伤组织。
d植株再生:原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗培养基上可一步成苗。
1、仙台病毒法
病毒促使细胞融合的主要步骤如下：两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。
2、聚乙二醇（PEG）法
PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加质膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能
聚乙二醇（PEG）法诱导细胞融合
?优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 ?缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 3、电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察
融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强
电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 动物单细胞的获得：
组织块切碎 Hanks溶液洗涤酶消化平衡盐溶液（BSS）漂洗细胞悬浮液（细胞+营养液） 胰蛋白酶：适用于细胞间质少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾及传代细胞等
胶原酶：对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等 链霉蛋白酶黏蛋白酶蜗牛酶 融合的影响因素 （一）植物细胞融合
1作用时间2 PEG分子量和纯度3 电厂诱导时，融合率和原生质体密度有关4融合液中加入CaCl2，可维持一定的电导率并对细胞有保护作用。 （二）动物细胞融合
1 亲本细胞表面性质2细胞种类3 氧气4 离子种类和浓度5 pH7.4-7.8 （三）微生物细胞融合
1 PEG的相对分子质量和用量2 无机离子3 温度4 亲本的亲缘关系5 原生质体的活性6 细胞浓度
HAT选择系统
? HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。
补救途径涉及两种酶：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）胸腺嘧啶核苷激酶(TK) 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞做为亲本之一。? HPRT -细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； ? TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。
?含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。
?杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在培养基中- 或- ? HAT，HPRT TK 亲本细胞死亡，只有杂种细胞存活。
原生质体的培养：子叶、下胚轴、叶片及愈伤组织无菌材料的培养→材料的预处理（预培养、黑暗、低温、质壁分离）→材料至菌液中降解（25±1℃，30rpm，8h）→400目尼龙网过滤，除掉大的杂质→滤液离心（500rpm，6min）→清洗液离心清洗（0.6mol/L，CPW甘）→培养基离心清洗（KM8p、MSp、MSe）→纯化原生质体悬浮液
第八章核移植技术与动物克隆
第一节 细胞重组
一、细胞重组（细胞拆分）是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种技术。
二、细胞重组方式：1. 胞质体与完整细胞重组形成胞质体杂种；2. 微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体；3. 胞质体与核体重新组合形成重组细胞
胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。