5 ．当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？为什么？
答：要避免星活性及部分酶切。（ 1 ）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（ 2 ）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将 DNA 重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（ 3 ）先低温酶，后高温酶；（ 4 ）使用通用缓冲液。
6 ．试计算下列三种限制酶各自在某染色体 DNA 序列上的切割概率 Sau3A I GATC Pst I CTGCAG Hinf I GANTC Acy I GPuCGPyC
答： 1/44 ； 1/46 ； 1/44 ；（ 1/44 ） x(1/22)
7 ．一长为 4.2kb 的 DNA 片段，分别用 EcoRI 、 PstI 及 EcoRI+PstI 消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱
0.7kb
0.7kb 0.8kb 1.5kb 1.4kb 2.0kb 2.0kb 2.8kb
EcoRI Pst I EcoRI + Pst I 答： EcoRI PstI EcoRI
0.7kb 0.7kb 0.8kb 2.0kb
回收与连接
一．单选题
1 ．用 DEAE 膜片法回收电泳分离的 DNA 片段时，在紧靠目的 DNA 片段前方的凝胶切一裂缝，以插入 DEAE 纤维素膜，该裂缝长度与 DNA 条带相比应（ C ）
A ． 略短 B. 等长 C. 略长 D. A 或 B 都可 E . A 、 B 、 C 都可
2 ．用透析膜插片凝胶电泳法回收 DNA 片段时，再区带前挖一小槽，将透析膜置于槽中，这时应注意（ B ） A ．透析膜要接触 DNA 区带一侧的胶缘 。 B ．透析膜不能接触 DNA 区带一侧的胶缘 。 C ．透析膜要接触 DNA 区带相对一侧的胶缘 。
D ．透析膜不能接触 DNA 区带相对一侧的胶缘 。 E ．随意插入槽中即可。
3 ．在回收 DNA 片段时，观察电泳结果为尽量减少对 DNA 的照射损伤应使用（ A ）
A ．长波长紫外 B. 短波长紫外 C . 长波长红外 D. 短波长红外 E. ABCD 都不可 4 ． DNA 回收时，如要除去 EB （溴化乙锭）可用下列那种试剂（ A ） A ．正丁醇 B. 苯酚 C. 氯仿 D. 异戊醇 E. 乙醇 5 ．在 DNA 分子克隆时，常用到部分填补法，填补时应注意（ E ） A ．控制反应温度 B. 控制酶的反应时间 C. 控制 DNA 聚合酶的用量 D. 控制反应 PH E. 限制 dNTP 的种类 6 ．下列关于平末端连接的说法正确的是（ B ） A ． 同等条件下连接效率高于粘末端连接的连接效率。 B ． 加入凝聚剂 PEG8000 可促进平末端连接。 C ． 平末端连接时反应温度要比粘末端连接温度高。
D ． 平末端连接方法的使用仅限于酶切后产生的两个平末端之间的连接。 E ． 平末端连接比粘末端连接更易产生自身环化。
7 ．用同一种酶切割载体和目的基因后进行连接，连接产物会含大量自身环化载体，采用下列哪种酶处理，可防止自身环化（ E ）
A ．核酸内切酶 B. 核苷酸激酶 C. 核酸外切酶 D. 末端转移酶 E. 碱性磷酸酶 8 ．分子克隆中用 T 载体主要是与下列哪种产物连接（ D ）
A ．单酶切产物 B. 双酶切产物 C. 同裂酶产物 D. PCR 产物 E. 酶切后形成的平末端产物 9 ．采用 BamH I 单切载体和目的基因后，进行重组连接前要（ D ） A ． 65 ℃处理 10 分钟使 BamH I 灭活。 B ． 用碱性磷酸酶处理载体防止其自身环化。 C ． 电泳检测酶切结果。 D ． A 、 B 、 C 都正确。 E ． 只有 A 、 C 正确。
10 ．粘末端连接的优点是操作简便且（ C ）
A ．可产生新的酶切位点 B. 载体易自身环化 C. 易于回收片段 D ．具有方向性 E. 选时更简便
二．多选题
1 ．重组连接时，反应体系必须的组分有（ A 、 C ） A ． Mg2+ B. BSA C. ATP D. PO43- E . EDTA
2 ． DNA 片段重组连接可用下列哪些方法（ A 、 B 、 C 、 D 、 E ） A ．平末端连接 B. 粘末端连接 C. 加接头连接 D. 同聚尾连接 E . T 载体连接
3 ．酚抽提法回收 DNA 片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应（ A 、 C ） A ．酚 B. 微量的 EB C. 琼脂糖 D. 少量的乙酸钠 E . 少量的乙醇 4 ．产生平末端的方法主要有（ A 、 B 、 E ） A ．用产生平末端的限制酶切 。 B ．用 klenow 片段补齐 5 ‘粘末端。 C ．用末端转移酶补齐粘末端。 D ．用 Taq 聚合酶补齐粘末端。 E ．用 S1 核酸酶降解粘末端。
5 ．在 DNA 重组连接时，常采用连接头连接（ linker ligation ），其作用是（ A 、 B 、 C 、 E ） A ．引入某些限制酶切位点。 B. 人工构建载体。 C ．增加调控元件。 D. 调整阅读框。
E ．通过接头引入与目的基因相同的限制酶位点，并对目的基因相应酶切点进行甲基化修饰保护，可保护目的基因不受限制酶破坏。
6 ．构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于（ A 、 B 、 C 、 D ） A ．避免载体自身环化 B. 提高连接效率 C. 控制外源基因的插入方向 D. 便于转化后的筛选 E . 便于修改阅读框
7 ．下列关于同聚物加尾法的说法正确的是（ A 、 B 、 C 、 D 、 E ）
A ．其核心是利用末端转移酶的功能，将载体和外源 DNA 的 3 ‘端再加上一端寡核苷酸。 B ．不易自身环化。 C. 连接效率高 D. 适用于 CDNA 克隆 E ．可能会产生某种限制酶切位点。
8 ．下列与 DNA 重组连接相关的说法正确的是 （ A 、 D 、 E ） A ．不匹配的粘末端可通过部分填补后连接。
B ． 同聚尾法连接不仅连接效率高，也易回收插入的片段。
C ．限制酶切割 DNA 后加入 EDTA-SDS 终止液抑制限制酶活性，将有利于重组连接。
D ． Mg2+-ATP 是 T4DNA 连接酶反应时的必须因素。
E ．平末端连接时，在反应体系中加入适量凝聚剂可提高连接效率。 9 ．下列哪些因素对保证较高连接效率是有利的（ A 、 C 、 D ） A ．高纯度 DNA 。
B ．载体与目的基因摩尔数之比为 1 ： 1 。 C ．载体与目的基因摩尔数之比为 1 ： 3~5 。 D ．连接反应体系中 DNA 浓度较高。 E ．连接反应体系中 DNA 浓度较低。
10 ．如果 DNA 分子重组时，需要用平端连接，下列哪些方法可形成平末端（ B 、 C 、 D 、 E ）。 A ． 3 ‘突出的粘末端用 DNA 聚合酶加 dNTPs 填平。 B ． 3 ‘突出的粘末端用核酸酶切平。
C ． 5 ‘突出的粘末端用 DNA 聚合酶 加 dNTPs 填平。 D ． 5 ‘突出的粘末端用核酸酶切平。 E ．利用切口为平末端的限制酶。
三、填空题
1 ．形成平末端的方法有 用产生平末端的限制酶切，用 S1 核酸酶切除粘末端 ，用 DNA 聚合酶填平粘末端。 2 ．载体与 CDNA 连接重组可用的方法有 同聚尾连接酶，加人工接头连接法。
3 ． DNA 片段重组连接时，如要克隆 PCR 产物， PCR 产物可直接用 T 载体连接，而无须用限制酶处理。 4 ．回收 DNA 片段时，在确定 DNA 条带位置时，应使用 长 波长紫外灯，以最大限度减少对 DNA 的照射损伤。 5 ．回收 DNA 片段时，常用 正丁醇 处理以除去 EB 。
6 ．在用单一限制酶切载体和目的基因并进行连接时，为防止载体自身环化，常用 碱性磷酸酶 处理载体，或用 α - 互补 进行筛选。
7 ． DNA 片段重组连接的方法主要有 平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接 。
四．简答题
1 ．如何将一平末端的 DNA 片段与 BamH I 形成的粘末端连接？
答：使用加接头连接法。人工合成一段含 BamH I 酶切位点的 DNA 短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用 BamH I 切割连接片段，即可形成 BamH I 的粘末端。 2 ．什么是同聚尾连接法？具有哪些优缺点？
答：同聚尾连接法是利用末端转移酶在载体和外源 DNA 的 3 ‘端各加上一段互补的寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在 DNA 连接酶的作用下，连接成重组 DNA 。
其优点在于（ 1 ）由于同一 DNA 两端粘尾相同，不会自身环化；（ 2 ）连接效率高；（ 3 ）用任何一种方法制备的 DNA 都可用这种方法连接。
其缺点在于（ 1 ）方法复杂；（ 2 ）外源片段较难回收；（ 3 ）由于添加了同聚尾，可能会影响外源基因表达。 3 ．什么是接头连接法？
答：人工合成或来源于某一质粒的小段含某限制酶位点的 DNA 与载体或外源 DNA 分子相连，这样便在载体或外源 DNA 上制造出新的酶切位点，即接头连接。 4 ．为什么用同裂酶进行体外重组效率最高？
答：同裂酶是指来源不同的限制酶切割 DNA 后，产生相同的末端。多数同裂酶产生的粘性末端并非完全一致而是有四个碱基相同，这样用同裂酶切割载体和目的基因后的连接产物常会失去原有的限制酶位点，这样用同裂酶进行重组时，限制酶切割反应后不用将该酶失活，即可直接进行重组连接，由于连接体系中原有限制酶存在，载体自连不会发生，从而保证了载体只同外源 DNA 的连接。
转化
一．单选题
1 ．下列哪种 DNA 结构在转化时能获得最高转化效率（ ） A ．线形双链 DNA B. 单链线形 DNA C. 完整的环状双链 DNA D ．开口环状双链 DNA E. A 和 C
2 ．下列表型中，哪种是基因工程上的理想的受体菌表型（ B ）
A. r+m+rec+ B. r-m-rec- C. r- m+rec+ D. r+m+rec- E. r-m-rec+
3 ．大肠杆菌出现感受态的生理期是 （ B ）
A ．潜伏期 B. 对数期 C. 对数后期 D. 平衡期 E. 衰亡期 4 ． CaCl2 法制备 E.coli 感受态细胞时，摄入ＤＮＡ温度是（ E ） A ． 0 ℃ B. 16 ℃ C. 37 ℃ D. 25 ℃ E. 42 ℃ 5 ．关于感受态细胞的下列说法不正确的是（ C ） A ．有人工感受态细胞和自然感受态细胞。 B ．具有可诱导性。 C ．有可转移性。
D ．不同种细菌出现感受态的生理时期不同。 E ．不同种细菌出现感受态的比例不同。