10 ． SSCP 电泳方式为： D A. 普通琼脂糖凝胶电泳 B. 低熔点琼脂糖凝胶电泳 C. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 D. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
11 ． SSCP 中使 DNA 双链起变性作用的试剂是： B A. EDTA B. 甲酰胺 C. 溴酚兰 D. Tris-HCl
12 ． SSCP 分离单链 DNA 片段是依据： B A. 单链 DNA 分子量大小
B. 单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小 C. 单链 DNA 带电量的大小
D. 单链 DNA 分子量和带电量的大小 三、 是非
1 ．迄今发现的质粒都是环状的。（错）
2 ．质粒 DNA 提取时，溶液Ⅱ需新鲜配置。（对）
3 ．如果溶菌酶溶液中 pH 值低于 8.0 ，溶菌酶就不能有效发挥作用。（对） 4 ．碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（错）
5 ． CsCl-EB 密度梯度离心法纯化 SC DNA 原理是根据 EB 可以较多地插入到 SC DNA 中，因而沉降速度较快。（错） 6 ．酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）
7 ．氯霉素扩增 DNA 时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（对）
8 ．碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（错）
9 ．酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对） 10 ． SSCP 对长链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比短链的高。（错） 11 ． SSCP 分析中非变性 PAG 电泳分离不能反映出分子量的大小。（对） 12 ． SSCP 可以检测出所有的单点突变。（错）
13 点突变对 SSCP 检出率的影响取决于该点在 DNA 链上的位置，点突变在 DNA 链中部要比在近端部容易被 SSCP 检测出来。（错）
四、 简答
1 ．简述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所包含成分及生化作用原理
溶液Ⅰ含葡萄糖和 EDTA ，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止 DNA 受机械作用而降解。 EDTA 可螯合 Mg 2+ 、 Ca 2+
等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（ Dnase 作用时需要一定的金属离子作辅基），另外， EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
溶液Ⅱ含 NaOH 和 SDS ，核酸在 pH 大于 5 小于 9 的溶液中是稳定的，但当 pH 大于 12 或小于 3 时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的 NaOH 浓度为 0.2N ，加入抽提液液时，该系统的 pH 就高达 12.6 ，因而促使染色体 DNA 与质粒的变性。 SDS 是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白； SDS 能与蛋白质结合成为 R 1 -O-SO 3 - ? R 2 + - 蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 Rnase 去除 RNA 时）受到干扰。
溶液Ⅲ是 NaAc-Hac 的缓冲液（ pH4.8 ）。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液 pH 调回中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3MnaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA 、 RNA 以及 SDS- 蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与 SDS- 蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
2 ．小量制备质粒 DNA 时发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。
由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化 DNA 。 3 ．溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？
添加 DTT 、β - 巯基乙醇，或 8.0mol/L 的尿素等增加敏感性。 4 ．从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。
方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制 RNA 酶的活性，它还能溶解带有长 poly （ A ）段的 RNA 分子。使用酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1 ）混合液可以使这两个问题迎刃而解，）
5 ．在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1-0.25M?
在 pH 为 8 左右的 DNA 溶液中， DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl ，使 Na+ 中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6 ． LiCl 在质粒 DNA 提取中的作用是什么？
沉淀大量蛋白质和高分子 RNA 。 7 ．简述 PCR-SSCP 基本过程。 1) PCR 扩增靶 DNA ；
2) 将特异的 PCR 扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链 DNA 分子； 3) 将适量单链 DNA 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
4) 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可
以判定该链构象发生改变，进而推断 DNA 片段中有碱基突变。
8 ．简述 RNA-SSCP 的基本原理。
RNA 有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达 90% 以上。另外， RNA 不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。 9 ． SSCP 图谱一般是二条单链 DNA 带，有时可能只呈现一条 SSDNA 带或三条以上的原因是什么？
主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象，有时三条以上的 SSCP 图谱是由于野型 DNA 片段和突变型 DNA 片段共同存在的结果。
10 ．分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状 DNA 在凝胶中迁移率大小顺序是什么？
超螺旋环状 DNA 迁移最快，其次为线状 DNA ，最慢为带切口环状 DNA 。 11 ． 影响 DNA 迁移率的因素有哪些？
影响 DNA 迁移率的因素有： DNA 分子的大小，琼脂糖浓度， DNA 的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。
基因工程复习题
2007年05月16日 星期三 21:36 基因工程复习题
1。举例说明基因工程的基本操作过程。
所谓基因工程，就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源性（DNA）基因在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地表达遗传给下一代的过程。
（例子自己找,多的是）
2.基因工程的研究意义和作用
基因工程在农业、林业、医药、食品、环保等行业和领域的研究和应用都取得了很大的进步，既为工农业生产和医药卫生等开拓了新途径，又给高等生物的细胞分化、生长发育、肿瘤发生等基础研究提供了有效的实验手段。在传统工业中，基因工程的运用可降低损耗、提高产量，同时不能减少污染，如今生物工业成为现代产业革命的重要组成部分。在农业生产中，转基因植物在抗病毒、抗虫、抗除草剂和品种改良等方面都取得了引人注目的成果，有的已被广泛应用于生产实践，使得相关农作物的产量得以显著提高。在生命科学领域，人们可以利用基因工程技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；建立基因诊断、治疗技术、并已开发出基因工程药物和疫苗广泛应用于临床，为疾病的预防、治疗提供了新方法，给患者带来了福音。
3.1 凝胶电泳的原理
凝胶电泳技术的原理是，在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。前者由DNA分子所带电荷量的多少而定，后者主要与DNA分子的大小及构型有关。DNA分子在通常使用的缓冲液中带负电，在电场中向正极移动。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系，大分子质量的DNA在电泳时比小分子质量的DNA移动得慢，这样我们能将不同大小的DNA分开。如将已知含有不同大小DNA片段的标准样品作电泳对照，那么可以在电泳后估计或计算出待测样品的分子质量。
PCR技术的原理
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重
复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
DNA芯片原理
基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA微点阵。就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，这就是基因芯片。一套完整的基因芯片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处理系统等。
基本原理：用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织的mRNA分别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的DNA片段进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。
基因文库包括基因组文库和cDNA文库
基因组文库：从供体生物制备基因组DNA，并用限制性内切酶切割生成适于克隆的DNA片段，然后在体外将这些DNA片段同适当的载体连接成重组体分子，并转入到大肠杆菌的受体细胞中去。
DNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。
与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。
基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受调控影响。cDNA文库编码的是不完全的编码DNA序列，因此受发育和调节因子的影响。
核苷酸测序有哪些方法，试述原理。
Sanger法是目前最常用的方法，也称酶法。在测序用的缓冲液中含有四种（2-脱氧的）dNTP及聚合酶。测序时分成四个反应，在每个反应中除上述成分外分别加入2，3-双脱氧的A，C，G，T核苷三磷酸ddNTP （即ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP）。在第一个反应物中，ddATP会随机地代替dATP参加反应。一旦ddATP加入新合成的DNA链，由于其3位的羟基变成了氢，所以不能继续延伸。第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了；同理，第二个反应产生的都是以C结尾的，第三个反应的都以G结尾，第四个反应的都以T结尾，电泳后就可以读出序列了。
Maxam-Gilbert法：一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 鸟枪法测序的操作方法
1. 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA, 并用Agarose凝胶电泳进行回收。
2. 对回收的大片段DNA用物理方法 (如超声波等) 进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段 DNA进行末端平滑化。
3. 进行Agarose电泳，切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的 3'端加上一个A碱基。
4. 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。 5. 对阳性克隆（含1 kbp ~ 2 kbp Insert）进行DNA测序。 6. 对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
应用Southern杂交技术，可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP图谱。
PCR技术应用
（一）遗传病的基因诊断
目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。
.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。 （二）传染病诊断
PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定
病原体基因扩增常用于检测及鉴定微生物，评价治疗反应和检测耐药性突变等。对感染性疾病的评价PCR已证明在许多情况下较传统方法更为优越，尤其是在鉴定不易培养，生长缓慢或不能培养的病原体时候，PCR可以快速（1~2小时内）提供诊断结果，并能同时分析多种样品；同时PCR不受药物治疗的干扰，可在治疗开始后确定感染原，为用药提供可靠的参考 1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。
2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等； （三）肿瘤基因诊断
1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras,p53；癌基因扩增和表达分析。 2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；
3、分析白血病（如CML）中异常染色体易位，检测微小残留病变（Minimal residual disease，MDR） 4、肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance,MDR）检测 5、端粒酶活性检测
杂交组织化学是运用核酸分子间碱基互补的性质，并结合组织化学和免疫组织化学技术，在组织切片上显示特异性核酸（DNA或RNA）片段的一种技术。由于该反应是在组织（细胞）原位，通过核酸分子探针与靶核酸间的互补杂交来实现的，故又称原位分子杂交。原位核酸分子杂交技术简称原位杂交，是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物带一定颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。原位杂交临床应用在细胞遗传学、产前诊断、肿瘤和传染性疾病的诊断、生物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。
苏州大学基因工程（02级生物技术专业）试题（A卷）
（2005.12）
姓名 学号 得分
一 名词解释（4分/题，共20分）
1． 重叠基因
2．.锌指结构