发酵工程 课程设计说明书
年产1吨工业纤维素酶发酵工艺设计
学生姓名： 学号：
学 院： 化工与环境学院 专 业： 生物工程 指导教师：
2011年 06月
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前言................................................................................................................................. 1 1纤维素酶简介 ................................................................................................................ 1
1.1纤维素酶的分类 ................................................................................................... 1 1.2纤维素酶的作用机理............................................................................................ 2 1.3纤维素酶的分子量、分子结构及等电点................................................................ 3
1.4产纤维素酶的主要微生物类群.............................................................................. 4 2产纤维素酶的菌种选育 .................................................................................................. 5
2.1 里氏木霉的特性 .................................................................................................. 5 2.2培养基 ................................................................................................................. 5 2.3 菌种 ................................................................................................................... 6 2.4酶活力测定 .......................................................................................................... 6 2.3菌种筛选与鉴定 ................................................................................................... 6 2.4诱变处理 ............................................................................................................. 7 2.5菌种保藏 ............................................................................................................. 8 3培养基的优化 ................................................................................................................ 9
3.1产酶培养基 .......................................................................................................... 9
3.2摇瓶种子培养 ...................................................................................................... 9 3.3产酶发酵培养 ...................................................................................................... 9 3.4生长曲线的绘制 ................................................................................................... 9 3.5纤维素酶活力测定 ............................................................................................... 9 3.6培养基的优化方法 ............................................................................................. 10 4培养基的灭菌 .............................................................................................................. 15
4.1微生物的热死灭动力学方程 ............................................................................... 15 4.2温度对K的影响 ................................................................................................ 15 4.3湿热灭菌 ........................................................................................................... 18 5种子扩大培养 .............................................................................................................. 20
5.1种子制备 ........................................................................................................... 20 5.2车间种子制备 .................................................................................................... 20 5.3 发酵过程 .......................................................................................................... 21 6发酵设备选取及物料衡算： ......................................................................................... 23
6.1发酵罐的工艺尺寸 ............................................................................................. 23 6.2物料横算 ........................................................................................................... 24 7下游加工 ..................................................................................................................... 25
7.1分子筛层析 ........................................................................................................ 25
7.2离子交换层析 .................................................................................................... 25 7.3 酶活力测定 ....................................................................................................... 25 7.4浓缩 .................................................................................................................. 27 7.5低温结晶 ........................................................................................................... 27 7.6分离、洗涤 ........................................................................................................ 27 7.7干燥磨粉 ........................................................................................................... 27 参 考 文 献 .................................................................................................................. 28
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前言
资源和环境问题是2l世纪人类面临的最主要挑战，纤维素与木质素、半纤维素及其它多糖一起构成植物细胞壁的主要成分，是生物圈最丰富的可再生资源和能源物资，是地球生物圈碳素和能量循环的主要部分。据估计，植物每年大约合成1000亿吨以上的纤维素中国的天然纤维素。原料也很丰富，每年的产量是11．45亿吨，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年就可以达7亿吨，其中玉米秸秆占35％，小麦秸秆占21％，稻草占19％，大麦秸秆占1096，高粱秸秆占5％，谷草占5％，燕麦秸秆占3％秸秆占2％，可见，玉米秸秆、小麦秸秆和稻草是中国最主要的三大秸秆。此外，来自于林业副产品、城市垃圾、工业废弃物中的天然纤维素原料数量也相当可观汹。
1纤维素酶简介
目前，纤维素材料除少量用于纺织、造纸和建筑外，人们对其开发利用还相当有限在当今不可再生资源和能源日益枯竭的今天，大力开发和转化利用木质纤维素这些可再生资源则十分必要。纤维素酶在现阶段已经广泛应用于包括食品在内的各个领域，今后还将在应用深度和广度上进一步扩展，现在纤维素酶的应用还存在一些问题，主要是生产菌种的优化问题和应用的成本问题，解决问题的主要方法在于现代生物技术的应用和酶工程的进一步探索，只要解决好这些问题，纤维素酶必将在各领域发挥更大作用。总之，纤维素酶是大有前途的新兴产业，其发展方兴未艾，前景广阔。
1.1纤维素酶的分类
纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，它是一类复杂的复合物，称之为纤维素酶系，根据其中各酶功能的差异，可将其分为以下三大类：
(1)内切葡聚糖酶：
来自真菌简称EG，来自细菌简称Len．又称为Cl酶，这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量含非还原性末端的小分子纤维素。
(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖酶：
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来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex，又称为Cx酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-D糖苷键，每次切下1个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶。
(3)β-葡萄糖苷酶：简称BG酶，这类酶将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。
1.2纤维素酶的作用机理
1.2.1几种纤维素酶的作用位点
纤维素酶是—类酶的总称，而非单一的酶。目前在各种酶对纤维素的作用机理上，特别是对Cl-Cx酶假设尚有争议。不过，下述四种酶的存在是众所公认的：(1)内切β-1，4-葡聚糖酶(endo-β1，4-glucanase，EC3．2．1．4，简称EG)。(2)外切β-1，4-葡聚糖酶(exo-β-1，4- glucanase，EC3．2．1．74)。(3)纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，EC3．2．1．91，简称CBH)。(4)纤维二糖酶(cellobiase，E C 3．2．1．21，简称BG)。所谓的Cx酶，系指(1)和(2)。其中纤维二糖水解酶又有内切和外切之分。而C1酶则被认为是(3)。图1-3表示这几种酶的作用位置。
图1-1 各种纤维素酶的作用部位
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1.2.2对纤维素分子的吸附作用
纤维素酶对纤维素的降解，一般首先需要吸附到纤维素上，但并不是好的吸附才有好的催化。纤维素酶的吸附不仅与酶本身的性质有关。也与底物的特性有密切相关，其能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。至于吸附过程是否可逆应视具体酶的种类而定。Nidotsky等发现，里氏木霉的CBH II和EGIII对纤维素的吸附是个可逆过程，而CBHI是个不可逆过程，同时还发现除CBHI外，酶组分吸附与相应的水解活力之间没有线性关系。此外，纤维素酶的吸附机制并末完全弄清，仍需做进一步研究。 1.2.3纤维素酶中单个组分的作用机制
纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制，即作用部分的两个色氨酸参与与基质结合，而处在将被裂解的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基参与催化作用。这些残基被非极性化的侧链围绕，以促进质子转移。打断N-乙酞粘质酸-N-乙酞氨基葡萄糖键。人们用定点突变技术和酶专一性抑制剂实验证明了谷氨酸位于细菌和真菌的CBH．EG和葡萄糖苷酶的催化位点，也有的纤维素酶是天门冬氨酸、组氨酸和精氨酸位于催化位点，参与催化反应。推测谷氨酸-33和天门冬氨酸-50参与葡萄搪内切酶催化：实验证明谷氨酸-65和天门冬氨酸-81，92可能是纤维二糖水解酶的催化残基。 1.2.4纤维素酶的协同降解机制
前面提及的几种不同功能的纤维素酶在分解过程中存在协同作用。该协同作用不但其作用顺序不是绝对的，就是各酶的功能也不是这样简单固定的。研究表明，EG和CBH都能引起纤维素的分散和脱纤化(沿着纤维素的经度轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维)。这样纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性微结晶利于进一步被降解。
1.3纤维素酶的分子量、分子结构及等电点
不同微生物产生的纤维素酶分子量差异很大，即使同一酶系中的酶也有较大差异。一般β-葡萄糖苷酶的分子量最大，常大于70kDa，有的甚至达400kDa。
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