3培养基的优化
3.1产酶培养基
用10g/L微晶纤维素取代20g/L葡萄糖，加入吐温-80 1.0 mL／L，其余成分与种子培养基(1)相同，pH调至4．8。
3.2摇瓶种子培养
将50 mL原始菌种接种到种子培养基(1)的250 mL锥形瓶中，121℃，30 min灭菌。接种后，于28℃，200 r／rain震荡培养2.5-3d，培养液浑浊，作为种子液。
50 mL种子培养基2的250 mL锥形瓶中，121℃，30 min灭菌。吸取2.5mL种子液，接人装有50 mL种子培养基2的250 mL锥形瓶中，28℃、200 r／min培养2 d。
3.3产酶发酵培养
吸取2.5 mL种子液，接入装有50 mL产酶基础培养基的250 mL锥形瓶中，28℃、200 r／min下发酵培养。
3.4生长曲线的绘制
菌丝体干质量曲线：从接种开始，每隔1 d取样，菌丝烘干称质量，直至9 d，绘制该菌株生长曲线，了解其生长周期。细胞干质量的测定方法：取5 mL稀释到适当倍数的培养液，加入5 mL l mol／L高氯酸溶液，沸水浴20min，测OD260，得[A]；同上面方法测得接种前培养基测OD260，得[B]。
质量浓度(g／L)=0．65 ╳([A]一[B])。
滤纸酶活的曲线：从接种开始，每隔1 d取样，测定产酶基础培养基中单氏木霉产生的纤维素酶的滤纸酶活，直至9 d，绘制该菌株滤纸酶活曲线，了解其生长周期内产酶情况，以利于找到菌体生长周期中最大的产酶的时间。
3.5纤维素酶活力测定
(1)葡萄糖(G)标准曲线的制作
取8支洗净烘干的25 mL具塞刻度试管，编号后按表3加入标准葡萄糖(G)溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加人3 mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至25 mL，
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充分混匀。在540 nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。
(2)滤纸酶活力的测定根据Ghose推荐的方法测定滤纸酶活。一个酶活单位(IU)定义为50℃下每分钟水解底物生成1 μmol葡萄糖。
0．5行加入10 mm×60 mm的滤纸条(约50 mg)，50℃水浴中保温60 min，迅速加入3 mLDNS溶液，混匀，沸水浴5 min，取出置于冷水中冷却。加纯水至25 mL，混匀，以1号试管溶液为空白对照调零点，540 nm下测定2、3、4号试管液的光密度值(光密度值在0．2～0．8 log之间)，根据3个重复光密度的平均值，存标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按式4.2.3计算出滤纸酶活力(U／g)：
3.6培养基的优化方法
3.6.1最佳工业纤维素浓度的选择
分别以浓度为10、20、30、40、50、60 g／L的工业纤维素作为单一碳源，替代产酶基础培养基中的微晶纤维素，制备液体发酵产酶培养基，各取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2．5 mL，接入上述培养基，28℃、160 r／min下培养24 h。
取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8 d的发酵液，用滤纸酶活力(FPA)法测定酶活，选取最佳工业纤维素浓度。 3.6.2最佳(NH4)2S04质量浓度的选择
以工业纤维素(浓度为30 g/L)为单一碳源，分别以浓度为8、10、12、14、16、18 g/L的(NH4)2S04。，制备液体发酵产酶培养基，各取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2．5 mL，接入上述培养基，28℃、200 r／min下培养24 h。
取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8 d的发酵液，用滤纸酶活力(FPA)法测定酶活，选取最佳(NH4)2S04浓度。 3.6.3最佳Mandels营养盐浓缩液浓度的选择
选取浓度为30 g／L工、Ip纤维素为单一碳源，浓度为12 g／L的(NH4)2S04。，分别吸取50、75、100、125、150、175、200 mL的Mandels营养盐浓缩液，制备液体发酵产酶培养基，各取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，做
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一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2.5mL，接人上述培养基，28℃、200 r／min下培养24 h。
取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8 d的发酵液，用滤纸酶活力(FPA)法测酶活，确定最佳Mandels营养盐浓缩液浓度。 3.6.4结果与分析 3.6.4.1葡萄糖标准曲线
根据不同浓度葡萄糖下测定的光密度值数据以葡萄糖含量(mg)为横坐标，对应的光密度值为纵坐标，绘出葡萄糖标准曲线，如图3-1所示。
图3-1 葡萄糖标准曲线
3.6.4.2生长曲线
菌丝体干质量曲线：从接种开始，每隔l d取样，菌丝烘十称质量，直至9 d，以培养天数(d)为横坐标，对应的菌体干质量(mg)为纵坐标，绘制该菌株生长曲线，了解其生长周期，绘制细菌生长曲线，如图3-2所示。
滤纸酶活的曲线：从接种开始，每隔l d取样，测定产酶基础培养基中纤维素酶的滤纸酶活，直至9 d，以培养天数(d)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制该菌株滤纸酶活曲线，如图3-3所示。
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图3-2 菌株生长曲线
图3-3 菌株产酶曲线
3.4.6.3最佳工业纤维素浓度的选择结果
在其他条件不变的情况下，以不同工业纤维素浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以工业纤维素浓度(g／L)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制图3-4。
由图3-4可知，其他条件不变的时候，工业纤维素含量为30 g／L，在5d时滤纸酶活达到最高，所以确定工业纤维素的最佳浓度为30 g／L。
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图3-4 不同工业纤维素浓度下的滤纸酶活
3.4.6.4最佳(NH4)2S04浓度的选择结果
在其他条件不变的情况下，以不同(NH4)2S04浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以(NH4)2S04浓度(g/L)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制图3-5。
由图3-5可知，其他条件不变的时候，(NH4)2S04浓度为12 g／L，在5d滤纸酶活达到最高，所以确定(NH4)2S04最佳浓度为12 g／L
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