外切纤维素酶的分子量一般在50kDa-60kDa左右。内切β-葡萄糖苷酶一般低于50kDa文献报道中，最小的内切纤维素酶分子量为5．3kDa。
多数真菌和少数细菌的纤维素酶都含糖基。糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解。同时纤维素酶由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异。导致酶的多形式和分子量的差别。
研究人员通过对纤维素酶一级结构和三级结构的研究发现。纤维素酶分子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域(catalytic domains，CD)、连接桥(1inker)和纤维素结合结构域(cellulose．binding domains，CBD)三部分组成。(1)连接桥：纤维素酶的连接区大多富含脯氨酸(Pro)和氢基氨基酸。连接桥的作用可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体：(2)纤维素结合结构域：它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。(3)催化结构域：它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。
等电点是蛋白分子的重要理化特征。纤维素酶系中各组分的等电点，随着菌种来源、培养条件的变化而差别较大。以棘抱曲霉为例，液体培养时各酶组分的等电点在3.5-5.02．间。但固体麸皮培养产生的酶组分，在等电聚焦电泳时，甚至可布在两性电解质载体3.5-10的整个pH跨度上。
1.4产纤维素酶的主要微生物类群
(1)细菌：主要有梭菌属Clostridium、纤维单胞菌属Cellulomonas、杆菌Bacillus、高温单胞菌属Thermomonospora、瘤胃球菌属Ruminococcus、拟杆菌Bacteriodes、欧文氏菌属Erwinia、醋弧菌属Acetovibrio、小双孢菌属Microbispora和链霉菌属Streptomyces等。纤维单胞菌C．firei和高温单胞菌T．f．sca是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌。
(2)真菌：主要有白绢菌Sclerotiumrolfsii、白腐真菌P．chrysosporium以及木霉属Trichoderrna、曲霉属Aspergillus、裂殖菌属Schizophyllum和青霉属Penicillium等种属中的一些真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌。世界纤维素酶市场中的纤维素酶20％是来自木霉属和曲霉属。
(3)放线菌：主要有链霉属，高温放线菌属和heremomonospora curvata等。
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2产纤维素酶的菌种选育
本实验选用里氏木霉发酵产纤维素酶。里氏木霉为好气菌，其菌落在PDA平板上生长快，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子呈深绿色产孢区常排列成同心轮纹状。菌落背面无色，有时呈浅黄色。菌丝透明，有隔，细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分支多，对生或互生二至三级分支，整体想树枝；分支与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶行，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺；单胞，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。以里氏木霉为出发菌种，经初筛、复筛、诱变后，用液体深层培养发酵生产纤维素酶，里氏木霉发酵生产的是胞外酶，经过分离纯化后，就得到纯化的纤维素酶制剂。
2.1 里氏木霉的特性
里氏木霉能用于生产纤维素在于以下几种特性：
1、 里氏木霉生产纤维素产量高。而且可以通过物理或化学诱变产生
高产菌株；
2、 里氏木霉容易培养和控制。
3、 里氏木霉产纤维素酶的稳定性好，不易退化。 4、 里氏木霉产生的纤维素酶是胞外酶，容易分离纯化。
5、 其代谢物安全无毒，不会影响人员和环境，也不会对纤维素酶的
生产造成不良影响。
2.2培养基
2.2.1 筛选培养基
磷酸二氢钠0.1％。硫酸镁0.05％，硫酸铵1.5％。琼脂2.0％．纤维素粉0.5％～1.0％，pH值为5.8～5.9。 2.2.2刚果红纤维索培养基
刚果红纤维素培养基的配制见参考文献[6]。 2.2.3液体发酵培养基
种子培养基(1)：葡萄糖20 g／L、蛋白胨1 g／LMandels营养盐浓缩液100 mL／L、Mandels微量元浓缩液1.0mL／L、l mol柠檬酸缓冲液50mL／L。
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种子培养基(2)：用10 g／L微晶纤维素取代20g／L葡萄糖，其余成分与种子培养基l相同。
其中，Mandels营养盐浓缩液有：(NH4)2SO4 14 g／L、(NH2)2CO 3 g／L、KH2P04 20 g／L、CaCl2?2H2O 4 g／L、MgS04·7H2O0.2 g／L；Mandels微量元素浓缩液有：FeS04·7H：0 5 g／L、MnS04·H2O 1-6 g／L、ZnS04·7H2O1.4 g／L、CoCl2·6H2O3．7 g／L；lmol／L柠檬酸缓冲液：柠檬酸(C6H8O7·H2O)210 g，H2O 750 mL，加NaOH 78 g，冷却后测pH约为4．2，加水至l 000 mL，pH约为4．5。
2.3 菌种
木材厂土壤中筛选到l株产纤维素酶活较高的里氏木霉。
2.4酶活力测定
2.4.1酶活力的测定方法
取发酵液于5000dmin离心10min，上清液即为用于测定的粗酶液。取50 mg Whatman NO．1滤纸条(1 cmx6 cm)，加l mL 0．05 M柠檬酸一柠檬酸钠液冲液(pH值为4．8)，加入适当稀释酶液50μI。，50℃反应30 min，加入DNS终止反应．沸水浴5 min。测还原糖。以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计算酶活力。
2.4.2酶活力计算方法
1个滤纸酶活力国际单位(FPAIU／mL)定义为：酶解反应中每分钟生成1.0mol/L葡萄糖(以还原糖计)的酶量。 4.2.3计算公式
1个滤纸酶活力国际单位(FPAIU/mL)?葡萄糖量(mg)?1000?稀释倍数180(葡萄糖分子量)?30min(反应时间)?0.05mL(酶液)
2.3菌种筛选与鉴定
通过初筛．从土样中选取92株能够在以纤维素粉为惟一碳源的平板上生长旺盛的菌株。将纯化后的菌株点到刚果红鉴别培养基上进行复筛。选取透明圈较大的菌株10株。通过摇瓶液态发酵。测定酶活力，最终选取1株活力最高的霉菌(见图1)。菌种鉴定特征为：在察氏培养基上，肉眼观察菌落迅速蔓延。形成较薄的菌丝层，菌落初期为白色、平坦，后期因产生分生孢子而呈深绿色。产孢
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区常排列成同心轮纹状．菌落背面无色．有时也呈浅黄色。镜检菌丝透明、有隔、细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出、无色、分枝多，对生或瓦生二至三级分枝．整体像树枝；分枝与分生孢子梗近似自角，末端为小梗，小梗瓶形；分生孢子球形或长椭图形，表面粗糙，布满小刺，单孢，靠黏液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。据此初步鉴定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科木霉属里氏木霉。
2.4诱变处理
2.4.1诱变处理过程
诱变前培养：把经在PDA培养基培养7天的孢子，用含0.1%吐温-80的缓冲液冲洗下，并移接到液体完全培养基上培养一段时间。
孢子悬液制备：把上述培养液经离心后，加入生理食盐水或缓冲液制成孢子悬液，孢子浓度为10个/mL~10个/mL。
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物理诱变：把用生理食盐水制成的孢子悬液，移接到平面皿中，在无菌条件下在15W紫外灯下，进行诱变处理。
化学诱变：把用缓冲液制成的孢子悬液，转移到一无菌试管中，并加入化学诱变剂（NaNO2或NTG），在摇瓶机内30℃、200处理一定时间后，经离心加入缓冲液制成孢子悬液。
中间培养：把 0.5mL 经处理的孢子悬液移接到10 mL、一定量的2-脱氧葡萄糖（2-DG）的完全培养基试管中，150r/min、28℃培养48h，再移接到一定量的2-脱氧葡萄糖完全培养基的试管中，150r/min、28℃培养24h。
取一定量上述培养液进行表面皿分离鉴定。 2.4.2变异菌株的筛选
表面皿筛选：把经上述诱变的菌悬液，首先涂布在含有一定浓度的2-脱氧葡萄糖培养基表面，经28℃，7~10天倒置培养，把出现较大纤维素水解透明圈的菌落，作为表面皿筛选的优良菌种。
初筛：把经表面皿筛选出的菌落移接到 50m╳150mL的L型大试管中，经150r/min、28℃、5~6天摇瓶培养后，分别测定滤纸酶活和CMC酶活，并把酶活较高的菌株作为初筛优良菌株。
复筛：把L型试管初筛的优良菌株，移接到装液
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50mL的300mL三角瓶，经150r/min、28℃、6~8天摇瓶培养后，分别测定滤纸酶活和CMC酶活，把酶活较高的菌株作为复筛的优良菌株。
分离纯化：把产酶稳定性比较好的菌株，再经表面皿分离纯化，摇瓶筛选出酶活较高的菌株作为下次诱变的出发菌株或产酶生产菌株。
用同样的方法，反复诱变，可得到抗分解代谢物阻遏的纤维素酶高产突变菌株，同时液使得纤维素酶的活力有了较大提高。
2.5菌种保藏
菌种保藏的要点是：选择适宜的培养基﹑培养温度和菌龄,以便得到健壮的细胞或孢子；保存于低温﹑隔氧﹑干燥﹑避光的环境中，尽量降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖；不被杂菌污染，在较长时期内保持著生活能力。
本设计中里氏木霉采用沙土管法保藏。将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀﹐放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态﹐可保存较长时期。
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