图3-5 不同(NH4)2S04浓度滤纸酶活
3.4.6.5 最佳Mandels营养盐浓缩液浓度的选择结果
在其他条件不变的情况下，以不同Mandels营养盐浓缩液浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以Mandels营养盐浓缩液浓度(mL／L)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制图3-6。
由图3-6可知，其他条件不变的时候，Mandeis营养盐浓缩液浓度为150 mL／L，在5 d时滤纸酶活达到最高，所以确定Mandels营养盐浓缩液最佳浓度为150 mL／L。
3.4.6.6正交试验结果与分析
根据单因素实验得到的各因素最优浓度，选取各因素上下共3个因素水平，利用正交试验设计软件设计正交试验，并记录该条件下滤纸酶活。根据记录的数据分别进行正交试验直观分析(极差分析)、方差分析。根据R值的大小可知，3个因素的主次顺序为：工业纤维素>(NH4)2S04>Mandels营养盐浓缩液。比较各因素不同水平的平均效果值知道本正交试验最优组合为30 g／L工业纤维素、12g/L (NH4)2S04、150 mL／L Mandels营养盐浓缩液效果较好。
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4培养基的灭菌
4.1微生物的热死灭动力学方程
实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动
?dNdt?k?N?1?力学，即：
N：任一时刻的活细菌浓度（个/L） t：时间（min）
lnNN0??K?t?2?K：比热死速率常数（min-1）取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得
N?N0?e?Kt?3?或
图4-1
实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120?C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。
4.2温度对K的影响
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微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征
K?A?e??E/RT?4? A：频率因子（min-1） ΔE：活化能（J/mol）
R：通用气体常数[J/（mol.k）] 从方程（4）可以看出：
（1）活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件相同时，ΔE越高，K越低，热死速率越慢。
（2）不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。 对方程（4）两边取对数，得方程（5）
lnK???ERT?lnA?5?
图4-2
dlnKdT?ER?T2??6?K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有关，对方程（5）两边对T取导数，得方程（6）。由方程（6）可得出结论：反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某些有效成分热破坏反应的ΔE较低（见下表）。将温度提高到一定程度，会
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加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少。
表4-1
受热物质 维生素B12 维生素B1盐酸盐 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 肉毒梭菌孢子 枯草杆菌孢子
ΔE（J/mol） 96232 92048 283257 343088 317984
如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的ΔEBS =67000× 4.184（J/mol），维生素B1的ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol），将灭菌温度从105?C提高到127?C，KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min-1），KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min-1）。
图4-3 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响
灭菌温度（?C）
达到灭菌程度的时间（min）
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维生素B1的损失（%）
100 110 120 130 140 150
843 75 7.6 0.851 0.107 0.015
表4-2
99.99 89 27 10 3 1
4.3湿热灭菌
在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌广泛采用湿热灭菌法。在工厂或实验室，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，湿热灭菌法是一种简单而又廉价、有效的灭菌方法。在利用蒸汽进行灭菌的过程中，由于冷凝时会释放出大量的潜热并具有强大的穿透能力，在高温及存在水分的条件下，微生物细胞内的蛋白质极易变性或凝固而引起微生物的死亡。如果培养基中含有大量的不耐热 （敏感性）微生物和相当数量的耐热性（芽孢）微生物则灭菌是微生物的残留变化可成为图 1 所示的情况从图 1 可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时
残留的活微生物等于 0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。考虑到灭菌时间对培养基营养成分的破坏，最常用的灭菌条件是 12℃，20 ～ 30 min。 4.3.1无菌的标准
根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。在此工程设计中取N=10-3。 4.3.2连续灭菌
连续灭菌也叫连消，就是将将配制好的并经预热（60～75℃）的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使其在短时间内达到灭菌温度（126～132℃）。然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持5～7分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）过的发酵罐内。其过程均包括加热、维持和冷却等灭菌操作过程。培养基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、薄板换热器式几种方式。 连续灭菌的基本设备一般包括：
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