1 材料与仪器
1.1 动物雄性SD大鼠,体质量180~200 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK (沪)2007-0005。
1.2 药品与试剂玄参提取物(1 g干燥提取物相当于61.7 g生药,主要含哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸及毛蕊花苷等苯丙素苷类物质),由上海中医药大学中药化学教研室提供;布洛芬混悬液,上海强生制药公司产品,批号080503102;维生素D3注射液,上海通用药业产品,批号060902 ;丙硫氧嘧啶片,批号801720,德国瑞姆斯制药股份公司产品;脂肪乳自配(每500 ml脂肪乳中含胆固醇25 g,胆酸钠5 g,丙硫氧嘧啶2.5 g,猪油75 g);TNF-αELISA试剂盒,批号:200812156;IL-1βELISA试剂盒,批号:200812156;IL-6ELISA试剂盒,批号:200812156;IL-10ELISA试剂盒,批号:200812156,均为上海西唐生物科技有限公司产品;兔抗鼠一抗,上海卓康公司产品,批号:860938;羊抗兔二抗,武汉博士德有限公司产品,批号:200903。
1.3 仪器BX51/BX52型系统显微镜,日本Olympus公司;Lamage-Pro plus 4.0 Media Cybernetics图象分析系统,L.P USA;DL 250RC2L离心机,上海中科生物医学高科技开发有限公司;DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪,芬兰Thermo公司。
2 方法
2.1 动物分组及给药40只SD大鼠,雄性,随机分为正常组、模型组、布洛芬组、玄参提取物低剂量组、玄参提取物高剂量组,每组8只。按照文献方法[3],采用一次性腹腔注射维生素D3,60万单位/kg,同时每天灌服脂肪乳10 ml/kg,连续70 d,制备动脉硬化大鼠模型。正常组一次性注射同等体积的生理盐水,并每天灌服蒸馏水。各药物组在造模的同时,每天给予相应的药物进行防治。玄参提取物低剂量组:灌服玄参提取物20.5 mg/kg;玄参提取物高剂量组:灌服玄参提取物41.0 mg/kg;布洛芬组:灌服布洛芬144.0 mg/kg;正常组和模型组:灌服等量蒸馏水。
2.2 检测指标
2.2.1 血脂、细胞因子的测定动物给药70 d后,禁食12 h,不禁水,25%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血,4 000 r/min,离心15 min,分离血清,将其分为5份, -20℃保存。1份血清用于血脂的测定:全自动生化分析仪测定大鼠的胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白水平,并计算高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值;其余4份用于炎症细胞因子的测定:ELISA法分别测定TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10的浓度,实验严格按照试剂盒步骤操作。
2.2.2 NF-κB的测定取腹主动脉,石蜡包埋与切片,免疫组化分析采用SABC法观察动脉中膜NF-кB的阳性表达,实验严格按照试剂盒的步骤操作。NF-кB活化表现为胞浆、胞核黄染,以核黄染为阳性细胞。观察位置为动脉中膜,每张切片选取细胞分布均匀的3个高倍视野作为观察区,计数3个视野内细胞数和阳性细胞数,计算阳性细胞率,取其平均值。染色结果参见阳性细胞半定量分析法[4]。在高倍镜下对细胞核内的反应作如下评分:
染色强度:0为无染色;1为染色弱;2为中等染色强度;3为染色强。
阳性细胞率:0为<5% ;1为<25% ;2为<50% ;3为<75% ;4为≥75% 。
以染色强度与阳性细胞率之和计算评分,0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(±),4~5分为阳性(+),6~7分为强阳性(++),其中“-~ ±”视为低表达,“+~++”视为过表达。
2.2.3 病理形态学观察取腹主动脉,浸泡于10%的福尔马林中,常规石蜡包埋、切片、HE染色观察动脉病变情况,并计算中膜厚度与血管内腔半径比值。血管内腔半径的计算方法:以像素为单位,用IPP图像分析仪测出血管内腔的面积S1,用S1=πR12计算出血管内腔半径R1;中膜厚度的计算方法:用图像分析仪测出中膜层加血管内腔面积S2,根据S2=πR22计算出血管内腔半径与中膜厚度之和R2,中膜的厚度R=R2-R1。