重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究
张 宁
1. 前言
在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。
关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞内表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子内及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。
表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用范围。
流程
培养基 成本 产率 表达量 蛋白折叠 胞外表达 细胞增殖周期
折叠 二硫键 N-糖基化 O-糖基化 磷酸化 酰化 γ-羧基化
适用
大肠杆菌
酵母
昆虫细胞
哺乳动物细胞
简单 简单 复杂 复杂 简单 简单 复杂 复杂 低 低 中 高 高 中 中 低 高 高 较高 较低 中 较好 较好 好 周质空间 分泌至培养基 分泌至培养基 分泌至培养基 30min 90min 18H 24H 常有错误折叠 偶有不当折叠 正确折叠 正确 难以形成 有 有 有 无 甘露糖残基，高 无唾液酸，简单 复杂 无 有 有 有 无 有 有 有 无 有 有 有 无 无 无 有
原核蛋白、简单真核蛋白、分泌真核蛋白、分泌复杂高等真核生真核蛋白 表达蛋白 表达蛋白 物蛋白
表1：常用表达系统比较
2. 原核表达系统
原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。 2.1 表达菌株
原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。
大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。同时，还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等，表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。
常用表达菌株
B834 B834(DE3) BL21 BL21(DE3)
BL21(DE3) BL21trxB(DE3) BL21trxB(DE3)pLysS
Origami Origami(DE3)
应用
met营养缺陷性，对照株，不能使
用T7启动子，蛋白酶敲除 met营养缺陷性，蛋白酶敲除 对照株，不能使用T7启动子，蛋
白酶敲除
常规表达宿主菌，蛋白酶敲除 高严紧表达宿主菌，蛋白酶敲除 常规表达宿主菌，在E.coli胞质中
形成二硫键，蛋白酶敲除 高严紧表达宿主菌，在E.coli胞质内形成二硫键，蛋白酶敲除 对照株，不能使用T7启动子 常规表达宿主菌，更好的在E.coli
中形成二硫键 高严紧表达宿主菌，更好的在
E.coli中形成二硫键
抗生素抗性
无 无 无
无
氯霉素（34μg/ml） 卡那霉素（15μg/ml） 卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml） 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml） 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml） 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml）
Origami(DE3)pLysS
Rosetta
Rosetta(DE3)
对照株，不能使用T7启动子，蛋
白酶敲除
常规表达宿主菌，lac
透性酶突变，可以控制表达水平，提供稀有密码子tRNAs，蛋白酶敲
除 高严紧表达宿主菌，lac透性酶突变，可以控制表达水平，提供稀有密码子tRNAs，蛋白酶敲除 对照株，不能使用T7启动子 常规表达宿主菌，更好的在E.coli胞质内形成二硫键，提供稀有密码
子tRNAs
氯霉素（34μg/ml）
氯霉素（34μg/ml）
Rosetta(DE3)pLysS 氯霉素（34μg/ml） 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml） 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml） 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（35μg/ml）
Rosetta-gami
Rosetta-gami(DE3)
高严紧表达宿主菌，更好的在
Rosetta-gami(DE3)pLysS E.coli胞质内形成二硫键，提供稀
有密码子tRNAs
表2：常用E. coli表达菌株
2.2 质粒载体：
大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要元件包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号肽，融合标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已经发展得比较完善，有多种质粒可供选择(表4)。
复制子：
复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下质粒拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷贝的质粒也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定，容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子，如pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要进行多个质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101和pUC共表达。
启动子：
表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式，启动子可以分为两类：组成型表达的启动
子使宿主不停地表达重组蛋白，常用于工业生产，如σ等；诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱导（诱导剂、温度等）时表达目的蛋白，诱导型启动子使重组蛋白的表达容易控制，同时降低了外源蛋白对细菌生长的影响。
S
图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂