检查终止密码，mRNA的通读会降低重组蛋白的质量和稳定性。不同终止密码子的终止效率在不同的物种中有很大差异，酵母和哺乳动物偏爱UAA和UGA，昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA；终止密码子3’端紧邻的碱基也会影响终止效率，对于UAG来说，终止效率U、A>C>G，其他终止密码G>U、A>C；也可以多加一个终止密码子，以确保翻译在正确的位点结束。
改变融合标签的位置，N端的标签可以帮助翻译起始，从而提高蛋白的表达量。 可溶表达低时：
错误折叠是引起重组蛋白可溶表达量低，包含体表达量高的一个重要原因。改善重组蛋白折叠的方法有：
降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；
减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好；
增加一个融合标签，或者更换一个分子量更大的标签。一般来说，越大的融合标签在提高重组蛋白溶解度方面效果越好，如MBP、GST的效果要优于His6标签。以改善溶解度为目的的融合标签最好放置在目的蛋白的N端；
改善二硫键的形成。大肠杆菌细胞内的还原环境会阻碍二硫键的形成，如果要表达有一对或多对二硫键、特别是需要二硫键来稳定分子内和分子间结构的重组蛋白，最好选用经过特别设计的载体和菌株，如pET39b(+)和pET40b质粒、BL21trxB， Origami和Rosetta-gami菌株。也可以考虑将蛋白分泌至周至空间，利用周至空间的氧化环境和酶来帮助二硫键的形成；
只表达蛋白的可溶片段。可溶片段突变体与全蛋白之间经常有很大差异，如等电点、抗原性、寡聚状态、活性、细胞定位等，突变时一定要谨慎考虑；
突变掉可能引起顺反异构的Pro。顺反异构伴随着很高的能量跃迁，是蛋白折叠的能量壁垒。突变掉这样的Pro可以显著帮助重组蛋白折叠，但是同样会改变蛋白性质，要谨慎考虑；
与分子伴侣和折叠酶共表达。微量的分子伴侣即可显著改善重组蛋白的折叠状况，与重组蛋白同源的分子伴侣效果更加明显。引入分子伴侣同样也会引起复制子相容性、额外的抗
生素抗性等问题，常用的分子伴侣有ATP依赖的DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES，以及定位于周质空间的分子伴侣SurA、PpiD等。折叠酶可以帮助蛋白跨过折叠过程的能量壁垒，使重组蛋白更快更好的折叠；
在重组蛋白N端加入信号肽，将其引导至周质空间，用跨膜过程来帮助蛋白折叠和二硫键形成，并减轻蛋白降解；
在培养基中加入重组蛋白的配体或底物类似物。配体结合，有时仅仅是配体的存在就能大幅度的改善蛋白的折叠和稳定性，此法不适用于无法被细菌摄取的配体；
如果是多个蛋白共表达，可以考虑用一段柔软的linker将两个蛋白连接起来，使溶解度好的蛋白帮助溶解度差的蛋白折叠；
改善蛋白稳定性。能够引起蛋白降解的因素很多，从蛋白自身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在表达时就被降解，表达量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。
处理高毒性蛋白：
外源基因的表达对大肠杆菌总有或多或少的影响，一般来说，经过改造的宿主可以在很大程度上容忍重组蛋白，重组蛋白可以占到细胞总蛋白量的50%或更高。但少数毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。以下方法可以降低重组蛋白的本底表达量。
在培养基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大肠杆菌的第一碳源，它的存在可以显著降低由其他碳源引起的本底表达。
采用严格启动的载体和宿主。如PBAD载体、pLacI宿主。
采用低拷贝数的载体。降低表达载体质粒的拷贝数，可以明显降低基础表达水平。如pETcoco载体在每个细胞中仅一个拷贝，而受到IPTG诱导时又可以高效表达重组蛋白。
采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。
除此之外，也可以通过共表达重组蛋白的抑制剂、提高抗生素浓度等方法提高毒性蛋白的表达量。
2.4 包涵体表达：
在使用高效的E. coli表达系统时，过量表达的重组蛋白常会在细胞内凝聚，形成无活性的包涵体沉淀。在早期实验中，包涵体被认为是重组蛋白表达的大敌：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低（~10%），容易纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。
与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多种物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。包涵体的表达相对简单，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的方法可以套用。
3. 酵母表达系统
酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点。酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
3.1 常用酵母表达系统(宿主-载体系统)
3.1.1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统
由于遗传和生理背景清楚而且安全，酿酒酵母是最早应用于重组蛋白表达的酵母宿主
菌。
表达菌株：
INVSC1是酿酒酵母表达系统的常用菌株，它是一种双倍体营养缺陷细胞株，在缺少组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的培养基中（如SC基本培养基）不能生长。GAL1是酿酒酵母表达系统中常用的启动子，以半乳糖作为碳源可以诱导转录起始，葡萄糖则抑制转录。在葡萄糖培养基中，重组蛋白只有本底水平的表达，收集菌体并转入只含半乳糖的培养基可以诱导重组蛋白表达。也可以使用棉子糖代替葡萄糖作为碳源，棉子糖对GAL1启动子没有影响，既不会抑制也不会激活，在菌体达到一定浓度之后直接加入半乳糖即可诱导重组蛋白表达。
酿酒酵母可以对重组蛋白进行乙酰化修饰，以及没有位点特异性的Ser/Thr磷酸化修饰，还可以进行Asn N-糖基化和Ser/Thr O-糖基化修饰。酿酒酵母的糖基化修饰采用单一的甘露糖残基，N-糖基化修饰由1，3-和1，6-甘露糖残基构成，往往形成40-200个甘露糖残基的较大糖链，通过基因改造可以阻断N-糖基化过程，使糖链缩短为Man8GlcNAc2核心糖链，糖链末端为1,3-甘露糖，使重组蛋白的抗原性明显增强。O-糖基化则由不超过5个的甘露糖残基聚合而成。
表达质粒
真核表达系统常采用穿梭质粒为表达载体。穿梭质粒含有两套复制子和启动子，以及相应的筛选标记，可以在原核和真核两种宿主中分别完成复制和表达，以方便对质粒进行遗传操作和大量制备。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒中，高拷贝载体通常采用酵母天然质粒的复制子，如2μ复制子，以使载体在宿主中达到较高的拷贝数（10-40），并独立于宿主染色体进行复制；低拷贝复制子则采用从酵母染色体中的自主复制序列（ARS）作为复制子，在宿主中严紧复制，通常一个细胞只有1-2个拷贝。真核表达载体常用的筛选标记有营养缺陷型（如URA3、TRP1）和抗生素抗性（如灭瘟素、G418等）。
载体 pYES2 pYES2/NT
启动子 μ2 μ2
筛选标记 URA3 URA3
融合标签 无 Xpress
pYES2CT pYES3/CT pYES6/CT pYC2/NT pYC2/CT pYC6/CT
μ2 μ2 μ2 CNE6/ARSH4 CNE6/ARSH4 CNE6/ARSH4
URA3 TRP1 灭瘟素 URA3 URA3 灭瘟素
V5, His V5, His V5, His Xpress V5, His V5, His
表5：常用酿酒酵母表达载体
整合型质粒（如Yip5）不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数一般很低。多拷贝整合载体pMIRY2通过将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)克服了这个缺点，利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。
酿酒酵母作为表达菌株具有一定的局限性，如缺乏强有力的启动子，重组蛋白产率往往只有全细胞蛋白的5%左右；难于高密度培养；分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白，有时蛋白只被分泌到周至空间而非培养基中；重组蛋白容易过度糖基化；内部降解复杂，重组蛋白的C端往往被截短。因此，现在一般使用甲醇酵母代替酿酒酵母，用于重组蛋白质的真核表达。
3.1.2 毕赤酵母（P. Pastoris）表达系统
毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，可以依赖甲醇作为唯一碳源生长，甲醇可以诱导代谢所需的酶的表达。目前发现的所有甲醇营养型酵母，其甲醇代谢途径都是相同的，甲醇首先被乙醇氧化酶（AOX）氧化，生成甲醛和过氧化氢。为了避免过氧化氢毒害细胞，这步反应在过氧化物酶体中进行。在毕赤酵母中，AOX有两个编码基因：AOX1和AOX2，其中AOX1基因编码了细胞内绝大多数的乙醇氧化酶。AOX1的表达受AOX启动子的严格调控，本底表达水平极低，而甲醇诱导表达量可以达到细胞总蛋白的30%以上，使用AOX启动子使得重组蛋白可以达到很高的表达量。
毕赤酵母中，His+转化子可以自发的进行高拷贝整合，概率为1-10%，选择带有HIS4基因的表达载体即可以提高外源基因的拷贝数，从而提高重组蛋白的表达水平。
毕赤酵母也是重组蛋白分泌表达的理想宿主。毕赤酵母本身只分泌表达少量蛋白，而且可以使用不含蛋白的培养基，因此分泌表达的重组蛋白在培养基中占据了绝对优势，大大